刚地弓形虫微线体蛋白5和16的基因序列分析及其免疫保护性研究

摘要

弓形虫作为一种呈世界性分布的专性细胞内寄生的顶覆门原虫，严重威胁着人类的健康，影响畜牧业的发展。孕妇感染弓形虫，会造成流产、产死胎、胎儿畸形。在畜牧行业，尤其是对山羊、绵羊以及猪等家畜，弓形虫感染会导致家畜的流产、产死胎、木乃伊胎等，给畜牧行业带来巨大的经济损失。
　　本研究首次研究不同宿主、地理来源以及基因型的刚地弓形虫虫株的TgMIC5和TgMIC16基因的序列变异情况，并验证其是否能够作为刚地弓形虫种群分析和基因分型的遗传标记。序列分析揭示，TgMIC5基因序列的遗传变异率仅为0.2-1.3％，无法有效区分不同基因型的弓形虫虫株，不能作为基因分型的标记分子用于弓形虫种群遗传学研究；TgMIC16基因序列的遗传变异率为0.1-0.9%，系统发育树分析表明TgMIC16基因能够区分不同基因型弓形虫，而PCR-RFLP方法进一步验证了TgMIC16基因能够区分不同基因型弓形虫。因此， TgMIC16基因是一个潜在的用于种群研究和基因分型的标记基因。
　　本研究还对TgMIC5、TgMIC16以及TgGRA16单独和混合免疫的保护性进行了评价。结果表明：免疫组小鼠血清中的抗体IgG以及抗体亚类IgG1和IgG2a的含量均有明显的升高；CD3+CD4+CD8?辅助性T细胞以及CD3+CD8+CD4?T细胞的含量明显增高。说明pVAX-MIC5和pVAX-MIC16能诱导小鼠机体产生高水平的Th1型细胞免疫和体液免疫应答反应。且经弓形虫RH株致死性和PRU株慢性攻击感染后，单基因免疫组和联合免疫组小鼠都能有效延长小鼠存活时间（空白对照组：4.1±0.31d、pVAX-MIC5：8.8±0.55d、pVAX-MIC16：7.8±0.33d、pVAX-MIC5+MIC16：10±0.63d、pVAX-MIC5+MIC16+GRA16：12.5±1.06d），减少脑包囊荷虫率（pVAX-MIC5：28.00%、pVAX-MIC16：39.44%、pVAX-MIC5+MIC16：48.06%、pVAX-MIC5+MIC16+GRA16：58.44%），且联合免疫的免疫效果显著高于单基因免疫。本研究说明这两个抗原具有良好的免疫原性，能诱导小鼠产生高水平的免疫应答以抵抗弓形虫的感染，且二者的联合适合于混合疫苗的研究。

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文献综述

1.弓形虫微线体蛋白1-MIC1

2.弓形虫微线体蛋白2-MIC2

3.弓形虫微线体蛋白3-TgMIC3

4.弓形虫微线体蛋白4-TgMIC4

5.弓形虫微线体蛋白5-TgMIC5

6．弓形虫微线体蛋白6-TgMIC6

7.弓形虫微线体蛋白——TgMIC7、TgMIC8、TgMIC9

8.弓形虫微线体蛋白10-TgMIC10

9.弓形虫微线体蛋白11-TgMIC11

10.弓形虫微线体蛋白13-TgMIC13

11.弓形虫微线体蛋白16-TgMIC16

引言

1.材料与方法

1.1 材料

1.2 方法

1.3 MIC5 和 MIC16 DNA 的疫苗免疫保护性研究

1.4重组质粒的免疫效果评价

2 结果与分析

2.1 弓形虫MIC5基因和MIC16基因的PCR扩增结果

2.2 重组质粒pMD18-MIC5和pMD18-MIC16的菌液PCR结果

2.3 弓形虫MIC16基因克隆子的PCR-RFLP分析结果

2.4 不同虫株之间MIC5基因和MIC16基因序列的遗传变异分析

2.5 弓形虫RH株pVAX-MIC5和pVAX-MIC16疫苗的制备

2.6抗体和细胞因子的检测

2.7 MTT及流式细胞检测结果

2.8 实验鼠腹腔注射感染弓形虫RH株的效果评价

2.9 实验鼠感染 PRU 株的脑包囊计数结果

3.讨论

结论

参考文献

致谢

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