CRISPR/Cas9技术编辑水稻香味基因及靶向突变检测方法的研究

摘要

香稻因其宜人的香味而受到全世界的青睐。传统的育种方式在一定范围内能够提高水稻产量和米质，但是效果不够显著，且工作量大，工作周期长。CRISPR/Cas编辑技术的发现和应用为分子育种开辟了新的途径。因编码甜菜碱醛脱氢酶基因BADH2功能缺失后，可导致一个主要的香气化合物2-乙酰-1-吡咯啉（2-AP）含量增多，使稻米产生香味。因此，本文利用CRISPR/Cas9靶向编辑技术，针对BADH2第2外显子和第7外显子分别设计靶标位点Badh2KO1和Badh2KO2，通过水稻遗传转化共获得转基因植株94株。通过对94株转化植株的BADH2基因测序结果可知，Badh2KO1的突变植株为25株，突变率27％;Badh2KO2的突变植株为59株，突变率63％;野生型植株为10株。通过遗传分离得到纯合突变植株。Sanger测序证实这些突变植株中BADH2基因发生碱基缺失和插入，致使编码蛋白的氨基酸序列均有不同程度的改变，且GC-MS技术检测出这些突变植株中的2-AP含量明显提高。这些结果表明，CRISPR/Cas9可以定向编辑水稻香味基因，使稻米具有香味。
　　突变检测是植物CRISPR/Cas9靶向突变研究的必要环节。为了比较不同检测方式的特点，本研究以一个水稻T0代CRISPR/Cas9靶向群体为材料，比较了目前常用限制性内切酶片段长度多态性分析、T7核酸内切酶分析、单链构象多态性分析、高分辨率溶解曲线分析以及直接测序分析等5种检测手段的准确性和灵敏性。我们的结果表明这些方法检出阳性结果的真实性均较高，但检出能力存在一定差别;进而也讨论了不同方法间实验周期和经济成本的差异。我们的工作为植物CRISPR/Cas9靶向编辑检测方法的选择提供了帮助。

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致谢

摘要

图表清单

文献综述

1 传统育种

2 水稻的分子育种和转基因技术

3 基因的编辑技术

3．1 ZFNs技术

3．2 TALEN靶向编辑技术

3．3 CRISPR／Cas9技术

4 水稻转基因的转化方法的简介

4．1 农杆菌介导转化技术

5 突变体的基因的检测

5．1 DNA测序(Sanger sequencing)

5．2 限制性内切酶分析法(RFLP)

5．3 T7核酸内切酶分析法(T7E1 Assay)

5．4 单链构象多态性分析方法(SSCP)

5．5 高分辨率熔解曲线分析法(HRM)

6 基因编辑育种思路

引言

1 材料与方法

1．1 材料

1．1．1 试验材料

1．1．2 培养基与缓冲液

1．2．1 载体的构建和转化

1．2．2 转化植株的遗传

1．2．3 T0代转化植株的突变检测

1．2．4 突变体DNA检测方法灵敏度的对比

2 实验结果与分析

2．1 载体的构建和转化结果

2．1．1 载体的构建分析

2．1．2 T0代转化植株阳性鉴定

2．2 转化植株DNA遗传分析

2．2．1 T0代植株突变

2．2．2 T1代植株突变遗传

2．2．3 T2代植株突变遗传

2．2．4 突变植株的香味分析

2．3 突变体DNA检测

2．3．1 不同方法对T0代转化植株的突变检测结果

2．3．2 灵敏度对比

3 讨论

4 结论

参考文献

附录

作者简介