第1 章绪论
1.1课题背景及研究目的和意义
1.2国内外研究进展
1.2.1 木霉生物防治进展
1.2.2几丁质酶性质及结构特征
1.2.3 微生物几丁质酶生物防治功能研究
1.2.4几丁质酶基因的调控
1.2.5几丁质酶在生物防治中的应用
1.2.6几丁质酶未来展望
1.3 研究中存在的问题
1.4 课题来源及主要研究内容
1.4.1课题来源
1.4.2 主要研究内容
第2 章 实验材料与方法
2.1实验材料
2.1.1 菌株和质粒
2.1.2 酶与试剂
2.1.3 培养基与溶液
2.2实验方法
2.2.1 棘孢木霉T4降解几丁质能力的确认
2.2.2 真菌总DNA的提取
2.2.3 真菌总RNA的提取
2.2.4 真菌RNA反转为cDNA
2.2.5 交错式热不对称PCR（Tail PCR）
2.2.6 扩增及实时定量PCR
2.2.7 细胞内蛋白提取
2.2.8 链霉亲和素磁珠的制备
2.2.9 链霉亲和磁珠与蛋白结合反应
2.2.10 凝胶迁移电泳
2.2.11 干扰质粒的构建
2.2.12 过表达质粒的构建
2.2.13 棘孢木霉潮霉素敏感性检测
2.2.14 原生质体制备
2.2.15 原生质体转化
2.2.16 细胞壁蛋白的提取
2.2.17 HPLC测定几丁二糖浓度
2.2.18 Western Blot 检测蛋白表达量
2.2.19 酶活测定
2.2.20 毕赤酵母真核表达
2.2.21 菌落生长直径的测量
2.2.22 镍琼脂糖亲和纯化
2.2.23 单因素实验设计
2.2.24 响应面优化试验
第3 章棘孢木霉内切几丁质酶基因调控因子的验证
3.1引言
3.2 内切几丁质酶42序列的检测
3.2.1 棘孢木霉T4降解几丁质能力的确认
3.2.2 棘孢木霉 ech42基因的获取
3.3 棘孢木霉T4 ech42启动子区序列的获得
3.4 棘孢木霉T4 ech42调控子的筛选
3.4.1 棘孢木霉T4总蛋白的提取
3.4.2 生物素标记磁珠的制备与蛋白筛选
3.4.3 CDK5蛋白的真核表达
3.4.4 ech42调控子EMSA验证
3.5 cdk5 基因的干扰与过表达
3.5.1 cdk5 RNA干扰与过表达质粒的构建
3.5.2 cdk5重组质粒的原生质体转化与菌株筛选
3.5.3 cdk5的干扰与过表达对Ech42表达量的影响
3.6 本章小结
第4 章 ABC 蛋白对几丁质酶产量的影响
4.1引言
4.2 abc-b基因干扰及过表达质粒的构建
4.2.1 abc-b干扰质粒的构建
4.2.2 abc-b过表达质粒的构建
4.3 abc干扰及过表达对ech42表达量的影响
4.3.1 abc干扰对ech42表达量的影响
4.3.2 abc过表达对ech42表达量的影响
4.4 abc-b干扰及过表达对T4生长情况的影响
4.4.1 ABC-B蛋白表达量变化对T4碳源利用的影响
4.4.2 ABC-B蛋白表达量变化对几丁寡糖转运的影响
4.4.3 几丁二糖转运效率对T4几丁质酶产量的影响
4.4.2的结果与此节结果说明，ABC-B蛋白可以有效地转运几丁二糖进入菌体；而几丁二糖可以诱导棘孢木霉 T4 体内的几丁质酶表达；同时从 4.4.1 我们观察到ABC-B不仅仅是几丁二糖的转运蛋白，很有可能也同时是所有几丁寡糖甚至是其它种类多糖被酶解后所得寡糖的转运蛋白。
4.5 本章小结
第5 章棘孢木霉T4 几丁质酶培养条件的优化
5.1引言
5.2 内切几丁质酶基因42毕赤酵母真核表达
5.3 Ech42不同培养条件下酶活力的测定
5.3.1 温度对几丁质酶Ech42活力的影响
5.3.2 pH对几丁质酶Ech42活力的影响
5.3.3 氮源对几丁质酶Ech42活力的影响
5.4 Ech42不同金属离子条件下酶活力的测定
5.5 cdk5/abc-b双过表达工程菌株的构建
5.6 cdk5/abc-b发酵条件的优化
5.6.1 野生型菌株的发酵单因素分析
5.6.2 野生型菌株的响应面分析
5.6.3 双基因过表达菌株的发酵单因素分析
5.6.4 工程菌株的响应面分析
5.6.5 最佳条件下工程菌株的ech42表达量检测
5.7 本章小结
结 论
参考文献
附 录
攻读博士学位期间发表的论文及其它成果
声明
致 谢
个人简历
哈尔滨工业大学;
