棘孢木霉几丁质酶基因tachi1在毕赤酵母中的高效表达

摘要

几丁质酶作为木霉菌防治植物病虫害的主要因子，在生物防治和环境保护等领域发挥着重要的作用。为了研究棘孢木霉（Trichoderma asperellum）几丁质酶及其酶学性质，明确生防机制，将棘孢木霉几丁质酶基因tachi1（不舍信号肽）克隆到分泌性表达载体pPIC9K上，构建重组表达质粒pPIC9K/tachi1，电击转化毕赤酵母GS115，筛选获得了高效分泌表达几丁质酶Tachi1的酵母工程菌GS-tachi1-K，对其进行甲醇诱导培养，通过单因素和正交试验对Tachi1的表达条件进行优化，纯化目的蛋白并进行酶学性质的研究。结果表明，GS-tachi1-K的最佳表达条件:pH为6.5，甲醇诱导浓度为0.5％，起始细胞浓度为OD600=2，甲醇诱导时间为180 h;几丁质酶Tachi1活力可达17.93 U/mL，蛋白表达量为6.19 g/L;表达的几丁质酶表观分子量约为44 kDa，酶反应最适的温度和pH分别为50℃和5.5，具有较宽的温度、pH适用范围;50℃以下保持较高的酶活力，在碱性条件下稳定性较差;米氏常数Km和最大反应速度Vmax分别为6.537 g/L和47.37×103μmol/L·min; Tachi1受Ag+、Hg2+、Cu2+、Fe2+和高浓度的SDS及β-巯基乙醇强烈抑制。几丁质酶基因tachi1生物信息学分析显示，该基因编码424个氨基酸;Tachi1属于糖基水解酶18家族内切几丁质酶，包含SIGGW底物结合位点和FDGIDVDWE活性中心位点，信号肽长度为22个氨基酸;含有1个潜在的N-糖基化位点;二级结构以α-螺旋、β-折叠和无规则卷曲为结构元件，三级结构为（α/β）8的圆桶形结构。重组几丁质酶可抑制多种病原真菌菌丝生长、孢子萌发和芽管伸长，其中对板栗疫病病菌、杨树腐烂病病菌和苹果腐烂病病菌的菌丝生长抑制作用较强。

目录

声明

摘要

第一章 绪论

1 几丁质酶的研究进展

1．1 几丁质酶的研究历史和现状

1．2 几丁质酶的分子生物学

1．3 几丁质酶的应用

2 巴斯德毕赤酵母表达系统的研究进展

2．1 毕赤酵母表达的优点

2．2 生物学特点

2．3 外源蛋白在毕赤酵母中的表达

3 研究的目的意义、研究内容与技术路线

3．1 选题的目的意义

3．2 研究内容

3．3 技术路线

第二章 棘孢木霉几丁质酶基因在毕赤酵母中的表达及表达条件的优化

1 试验材料

1．1 菌株和质粒

1．2 酶和生化试剂

1．3 主要仪器和设备

1．4 有关溶液及培养基的配制

2 试验方法

2．1 几丁质酶基因tachi1在毕赤酵母中的表达

2．2 几丁质酶Tachi1表达条件的优化

3 结果与分析

3．1 几丁质酶基因tachi的毕赤酵母转化及表达

3．2 几丁质酶Tachi1表达条件的优化

4 讨论

4．1 棘孢木霉几丁质酶基因在P．pastoris中的表达

4．2 几丁质酶Tachi1表达条件的优化

第三章 棘孢木霉几丁质酶的分离纯化与酶学性质研究

1 材料

2 方法

2．1 酵母工程菌GS-tachi1-K的发酵培养

2．2 棘孢木霉几丁质酶的分离纯化

2．3 几丁质酶Tachi1的酶学性质研究

2．4 蛋白质分子量的测定

3 结果与分析

3．1 几丁质酶Tachi1的纯化及SDS-PAGE分析

3．2 几丁质酶Tachi1酶学性质分析

4 讨论

4．1 毕赤酵母表达外源蛋白的分离纯化

4．2 微生物几丁质酶的酶学特性

第四章 棘孢木霉几丁质酶Tachi1的生物信息学分析及抑菌效能研究

1 材料

2 方法

2．1 几丁质酶Tachi1的生物信息学分析

2．2 几丁质酶Tachi1对植物病原菌的抑制作用

3 结果与分析

3．1 几丁质酶Tachi1的生物信息学分析

3．2 重组几丁质酶Tachi1的抗菌活性

4 讨论

4．1 几丁质酶的结构

4．2 几丁质酶的抑菌活性

第五章 结论与展望

1 结论

2 展望

参考文献

英文缩略词及中文对照表

致谢

作者简历

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