HBs转基因小鼠引发肾炎的定量蛋白质组学研究

摘要

乙型肝炎病毒（HepatitisBVirus，HBV）是一种在全球范围内分布的具有感染性的人类病原体，尤其在撒哈拉以南的非洲、太平洋地区，特别是亚洲高度流行。生活在慢性高HBV患病率地区的人口占到全球人口的45%，其已经感染的人口达到4亿，使得HBV成为常见的人类病原体，严重影响社会经济发展。HBV是嗜肝DNA病毒家族的一员，其慢性感染（ChronicHBV，CHB）会引起多种肝病，包括无症状HBV携带者（AsymptomaticHBVCarrier，ASC）、慢性肝炎（ChronicHepatitis，CH）、肝硬化（LiverCirrhosis，LC）和肝癌（HepatocellularCarcinoma，HCC）等。　　在HBV感染的急性和慢性肝病患者中观察到多种肝外临床表现，肾功能紊乱仍是最常见的肝外临床表现。这种由于乙肝病毒感染导致的肾病称为乙型肝炎病毒相关性肾小球炎(HBV-associatedGlomerulonephritis,HBV-GN)，其可能的致病机制假说包括：HBV抗原（HBAg）和抗体（HBAb）免疫复合物结合所介导的典型免疫复合物肾小球肾炎；第二种宿主和病毒遗传因子所致的机体免疫功能缺陷，进而导致肾炎；自身免疫影响；以及病毒直接效应作用肾脏器官这几种原因导致肾脏炎症发生。通过原位杂交、阳性信号定位和Southern都能够在HBV-GN患者的肾小球系膜细胞和肾小管上皮细胞的胞核中检测到阳性HBV-DNA，证明机体存在病毒直接效应机制。但HBs（HepatitisBs）直接作用肾脏后致肾病的研究少，分子机制不明。　　本课题利用HBs基因稳转小鼠（Musmusculus）模型，借助TMT标记的定量蛋白质组学实验方法、利用加权共表达等生物信息学方法系统性分析探究HBs可能的致病机制。分别取6个月、12个月龄的野生型（Wild-type,WT）对照小鼠和HBs转基因小鼠（Transgenic,Tg）肾组织作为样本进行TMT标记。以6个月野生型小鼠（6m_WT）作为生物学重复，所有样品等量混合后进行离线液相色谱分离，再进行LC-MS大规模蛋白质鉴定和定量，以观察HBs的致病机制以及随着感染变化导致的蛋白质组学差异。我们共鉴定5127个蛋白，二级谱图总数为665687张；二级谱图解析率为23.4%；其中双肽段以上占比超过85%。加权共表达分析网络（Weightedgeneco-expressionnetworkanalysis，WGCNA）利用Pearson计算两两蛋白间的相关性系数，将相关性高的蛋白聚集到一起，定义为一个模块。将分类变量，野生型/转基因样品，分别转化为数值变量（0/1）导入计算。借助加权共表达分析网络算法将差异蛋白划分为棕色、绿色和蓝色三个模块。再将模块与是否为转基因感染表型联系起来进行相关性分析，发现绿色模块与表型显著性相关。其中与表型显著性相关的差异蛋白有127个。进一步将差异蛋白和HBs转基因鼠随时间变化进行聚类，可分成4种类型。　　利用Metascape、IPA和Reactome对所发现的差异蛋白进行生物反应富集分析，发现HBs转基因致肾病的三种可能机制。（1）HBs介导溶质转运（SoluteCarrie，SLC）相关蛋白的统一下调，引起肾脏的损伤；（2）HBs作为免疫原激活肾脏补体反应，进而介导肾脏的炎症通路；（3）HBs表达引发细胞凋亡，释放细胞色素，进而介导PPAR通路和炎症通路的异常。不仅如此，我们还发现5个随HBs感染时间延长持续高表达的蛋白FABP1、PNKD、ECI3、PRL15和HACL1。已知核糖体蛋白质L15（PRL15）的高表达促进癌细胞的增殖；而肝型脂肪酸结合蛋白（Liver-typefattyacid-bindingprotein,L-FABP或FABP1）与慢性肾病发展有关，可作为肾小管间质损伤敏感的预测指标。

目录

声明

第一章 绪 论

1.1 乙型肝炎病毒基因编码蛋白

1.2 乙肝病毒表面抗原的致病性研究现状

1.3 肝病伴随的肾病及其肾病表型

1.4 肝病伴随的肾病可能的致病机制

1.5 关键科学问题

1.6 基于质谱的蛋白质组学分析方法

1.7 疾病蛋白质组学疾病研究策略概述

1.8 TMT定量蛋白质组学技术研究进展

1.9 课题研究方案和内容

第二章 HBs 转基因小鼠定量蛋白质组学分析

2.1 实验材料和仪器

2.2 实验方法

2.3 TMT定量数据基本信息分析结果

2.4 小结

第三章 定量蛋白质组数据的生物信息学分析研究

3.1 生物信息学方法

3.2 结果和讨论

3.3 小结

第四章 结 论

参考文献

附录

致谢

个人简介及攻读学位期间取得的研究成果