糖浓度增加致海马神经元MLCK升高对细胞微丝骨架的影响

摘要

目的：原代培养 SD新生鼠海马神经元，倒臵显微镜观察海马神经元的形态，透射电镜观察其超微结构；Western blotting检测MLCK、p-MLC表达水平；免疫荧光染色，激光共聚焦显微镜下观察 F-actin的变化；探讨糖浓度增加海马神经元中 MLCK升高对神经元微丝骨架的影响，推测其改变在糖尿病认知功能障碍中的机制。　　方法:1.原代培养SD新生鼠海马神经元及其纯度鉴定：无菌条件下分离SD新生鼠海马并进行原代培养，倒臵相差显微镜观察细胞形态；每2天采用CCK-8检测海马神经元活性，细胞培养至第7天，NSE免疫组化染色鉴定其纯度；2.实验分组：对照组、高糖组、ML-7组。其中，对照组用葡萄糖浓度为25mmol/L的培养基培养；高糖组细胞培养至第5天换用糖浓度为45mmol/L培养基培养48小时；ML-7组在高糖作用的同时加入 MLCK抑制剂ML-7（20μmol/L）作用8小时。3. Western blot检测各组细胞内MLCK、p-MLC表达水平。4.透射电镜观察各组海马神经元超微结构改变。5.进行免疫荧光染色，激光共聚焦显微镜下观察各组微丝成分F-actin的变化。　　结果：1.成功培养海马神经元，倒臵相差显微镜下观察培养7d的神经元形态成熟，体积较大，聚集存活，光晕明显；突起发达并向外延伸，互相连接形成密集交错的网络。且培养7天的海马神经元细胞活性达到最高，之后产生短暂的平台期，11d后活性逐渐下降，经鉴定细胞纯度达90％以上；2.与对照组相比，高糖组细胞内p-MLC、MLCK均上调（P＜0.05），ML-7组 p-MLC、MLCK均较高糖组表达下调（P＜0.05）；3.与对照组相比，高糖组海马神经元突触缩短，超微结构显示海马神经元细胞核膜皱缩，细胞核形态不规则，核内染色质分布不均、颗粒化、凝集成块并边集，细胞内质网，线粒体有囊泡化扩张，伴随有自噬现象的产生，且微丝成分减少；与高糖组相比，ML-7组在细胞及线粒体方面无明显变化，细胞中出现极少自噬现象，内质网等细胞器改变不大，微丝更丰富。4.免疫荧光显示高糖组细胞形态改变，F-actin发生解聚、重排，且轴突、树突退缩；与高糖组比较ML-7组细胞形态完整，F-actin带清晰。　　结论：1.糖浓度增加使海马神经元内MLCK、p-MLC表达增加；2.糖浓度增加导致海马神经元形态及超微结构发生改变；3. MLCK和p-MLC表达升高，引起F-actin解聚，神经元细胞骨架重排；MLCK抑制剂ML-7可阻断F-actin的解聚。

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英文缩略词表

0引言

1 材料与方法

1.1 材料

1.2 方法

2 结果

2.1海马神经元培养及纯度鉴定

2.2 Western blot检测海马神经元细胞MLCK、p-MLC的表达水平

2.3透射电镜下海马神经元超微结构的改变

2.4激光共聚焦显微镜下F-actin的改变

3 讨论

3.1海马神经元原代培养的优化

3.2 糖浓度增加使海马神经元MLCK、p-MLC表达升高

3.3 MLCK升高与海马神经元超微结构的相关性

3.4 MLCK、p-MLC升高对F-actin的影响

4 结论

参考文献

综述：神经元细胞骨架的研究进展

作者简历

致谢

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