紫苏脂肪酸脱饱和酶基因克隆与应用

摘要

紫苏[Perilla frutescens(L.)]是唇形科(Labiatae)紫苏属(Perilla)的药食兼用型油料植物，其α-亚麻酸（ALA）含量在陆生植物中极高。ω-3脂肪酸脱饱和酶（ω-3FAD）能催化亚油酸形成ALA，增加微生物和植物体中得ALA含量。本研究对形成至完熟7个发育时期的紫苏种子进行了转录组测序和分析，筛选和克隆紫苏ω-3脂肪酸脱饱和酶基因(pfFAD3)后，进行原核表达，创制产亚麻酸工程菌株，为AlA的工业生产以及油料等作物品质的分子改良提供依据。　　本研究主要内容包括：⑴利用illumina测序对7个(2d,6d,10d,14d,18d,22d,26d)不同形成时期的紫苏种子RNA进行测序，经组装拼接共得到了64,156个unigene，从中发现约150个基因与脂肪酸的合成与积累相关联，与高表达脂肪酸脱饱和酶(FAD)关联性很高的转录因子有15个。⑵从转录组数据中挖掘出3条紫苏ω-3脂肪酸脱饱和酶基因(pfFAD3s)，最高FPKM分别为2325.59、33.36、42.30。将扩增出表达量最高一条命名为pfFAD3。通过Real-time PCR对其进行表达模式验证，发现pfFAD3基因在花和叶中低表达，其主要表达部位为种子；从种子发育的第2d开始表达量逐渐上升，18d时最高，之后下降；该表达趋势与RNA-seq分析结果接近。⑶从紫苏种子中克隆出pfFAD3基因并构建其pBlunt-pfFAD克隆载体，并利用pMal-c2X质粒构建了pfFAD3的原核表达载体pMal-c2X-pfFAD3。通过热激法将pfFAD3基因导入大肠杆菌，经PCR鉴定和测序验证后，用IPTG诱导工程菌表达出FAD3融合蛋白，脂肪酸含量检测表明，重组工程菌中的AlA含量增加了0.91%，显著高于野生型菌株。⑷以密码子组成为基础的异源表达分析表明紫苏种子编码基因偏好使用以A/T结尾的密码子，酿酒酵母是pfFAD3s适宜的表达宿主菌。

目录

缩写词

一 文献综述

1 基于二代测序的转录组研究进展

2 植物油脂研究概述

3 紫苏ω-3脂肪酸脱饱和酶研究进展

4 基因工程在油脂合成调控及生产中的应用

5 研究目的及意义

二 材料和方法

1 试验材料

2 试验方法

三 结果与分析

1 紫苏种子形成时期的转录组数据分析结果

2 紫苏pfFAD3s基因的特性

3 重组工程菌的获得

4 pfFAD3原核表达情况

5 紫苏种子密码子偏好使用情况

四 讨论

五 总结

1 结论

2 创新及展望

致谢

项目资助

参考文献

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