声明
第一章：轮状病毒亚单位疫苗研究进展
1 轮状病毒研究简介
1.1 轮状病毒结构
1.2 轮状病毒的类型
1.3 轮状病毒疫苗研究进展
2. VP6亚单位疫苗研究进展
2.1 轮状病毒结构蛋白VP6 简介
2.2 VP6 蛋白作为候选疫苗的研究进展
第二章 基因编辑技术与转基因动物
1 传统的转基因动物研究技术
1.1 原核注射法
1.2 胞质注射法
1.3体细胞核移植法
1.4 胚胎干细胞法
1.5 病毒载体介导法
1.6 精子载体法
1.7 转座子技术
2 基因编辑技术
2.1 锌指核酸酶(ZFN)技术
2.2 转录激活因子样效应物核酸酶（TALENS）技术
2.3 CRISPR-Cas9 基因打靶技术
3 CRISPR/Cas9研究进展
3.1 CRISPR/Cas 系统研究简介
3.2 CRISPR/Cas9 介导的基因编辑动物
3.3 CRISPR/Cas9 介导的基因敲入
3.4 动物乳腺生物反应器与基因编辑
第三章 DNA双链断裂与断裂修复途径的选择
1.DNA双链断裂
2 NHEJ 修复涉及的相关的修复蛋白
2.1核酸酶
2.2 聚合酶
2.3 连接酶复合体
2.4多核苷酸激酶，抑肽酶和酪氨酰DNA磷酸二酯酶1
3 不同末端结构介导的NHEJ修复途径
3.1 Ku-XRCC4-DNA连接酶介导的平末端连接
3.2 核酸酶依赖性修复途径
3.3 聚合酶依赖性修复途径
3.4 XLF和PAXX介导的连接修复途径
4 其他修复途径的选择
4.1 微同源序列介导的末端修复（a-EJ 修复途径）
4.2 单链退火（SSA）修复途径
4.3 同源重组修复
4.4 细胞周期对修复途径的影响
研究目的与意义
第四章：CRISPR/Cas9介导的兔酪蛋白位点基因组编辑效率检测
摘 要
前言
1 实验材料与仪器设备
1.1 实验材料
1.2 实验药品与试剂
1.3 主要溶液的配制
1.4 实验仪器与设备
2 实验方法
2.1 兔酪蛋白位点gRNA 的设计及CRISPR/Cas9 相关载体的构建
2.2 RGS 双荧光报告载体构建
2.3质粒转化及Cracking 鉴定
2.4 PCR 片段及酶切产物胶回收
2.5 去內毒质粒大提
2.6 细胞解冻与培养
2.7 Cas9 载体、gRNA 载体与RGS 载体脂质体共转染293T细胞
2.8 Cas9 载体、gRNA 载体共同电转染兔胎儿成纤维细胞
2.9 细胞基因组的提取
2.10 靶序列位点T7E1酶切突变检测
2.11 体外转录
2.12 兔的超排与受精卵的收集
2.13 兔受精卵胞质注射
2.14 统计分析
3 实验结果
3.1 兔CSN2 基因分析及酪蛋白WB检测
3.2 兔CSN2 位点gRNA设计及CRISPR/Cas9 相关表达载体的构建
3.3 双荧光报告载体RGS 载体的构建
3.4 Cas9、gRNA及RGS 载体通过脂质体共转染293T 细胞验证4条sgRNA切割活性通过脂质体共转染Cas9 载体、sgRNA 载体及RGS 载体到293 T细胞，转染48 h
3.5 Cas9载体及gRNA载体共同电转兔胎儿成纤维细胞验证4条gRNA基因组内源性靶位点的编辑效率
3.6 CRISPR/Cas9 介导的4条sgRNA在胚胎水平基因编辑效率检测
4 讨论
第五章：不同长度同源臂对EGFP基因定点敲入兔酪蛋白位点的影响
摘要
前言
1 实验材料与仪器设备
1.1 实验材料
1.2 实验药品与试剂
1.3 实验溶液的配制
1.4 实验仪器与设备
2 实验方法
2.1 靶向兔酪蛋白位点不同长度同源臂打靶载体的构建
2.2 Cas9、gRNA、同源打靶载体共转兔成纤维细胞
2.3 定点敲入外源基因的检测
2.4 Cas9、gRNA、同源打靶载体共注射兔受精卵
2.5 囊胚基因型的分析
3. 实验结果
3.1 靶向兔酪蛋白g4 位点200 bp同源臂打靶载体的构建
3.2 靶向兔酪蛋白g4 位点1000 bp同源臂打靶载体的构建
3.3 EGFP-Donor1与Cas9、gRNA4 共同电转兔成纤维细胞定点敲入的验证
3.4 EGFP-Donor2与Cas9、gRNA共同电转兔成纤维细胞定点敲入的验证
3.5两种打靶载体分别与Cas9mRNA、sgRNA4共注射兔受精卵基因敲入效率的检测在成纤维细胞水平验证了两种不同长度同源臂打靶载体均具有活性，且能介导同源
4 讨论
第六章：靶向酪蛋白位点定点整合VP6转基因兔的制备
摘要
前言
1 实验材料与设备
1.1 实验材料
1.2 实验药品与试剂
1.3 主要溶液的配制
1.4 实验仪器与设备
2 实验方法
2.1 轮状病毒亚单位结构VP6 基因打靶载体的构建
2.2 Cas9 质粒、gRNA4 质粒及VP6-Donor质粒共同电转兔成纤维细胞
2.3 Cas9mRNA、sgRNA4 及VP6-Donor质粒共注射兔受精卵
2.4 胚胎移植
2.5 F0代仔兔的基因型检测
2.6 Southern Blot
2.7 F0-B6阳性兔的脱靶检测
2.9 F1代阳性兔乳汁的采集及外源蛋白Western Blot 检测
3. 实验结果
3.1 轮状病毒免疫原性结构蛋白VP6 打靶载体的构建
3.2 Cas9、gRNA4、VP6-Donor载体电转兔成纤维细胞基因敲入的验证
3.3 Cas9、gRNA4、VP6 Donor载体共注射兔受精卵基因敲入效率的检测
3.4 F0代转基因兔的检测
3.5 三只阳性兔Southern blot 分析
3.6 F0代敲入阳性兔Rabbit1（F0-B6）的基因型分析
3.7 F0-B6阳性兔的脱靶检测
3.8 F0-A3后代的扩繁及F1 代仔兔的转基因检测（生殖系遗传）
4 讨论
全文结论
参考文献
附录
致谢
攻读博士期间发表论文
广西大学;
