果胶甲酯酶在香蕉枯萎病菌不同小种致病过程中的功能研究

摘要

香蕉（Musa spp.）是全世界主要的水果之一，而且在发展中国家也被认为是第四大粮食作物，但是香蕉的产量一直受很多因素的影响，其中最重要的为尖孢镰刀菌古巴专化型（Fusarium oxysporumf. sp.cubense，Foc）侵染引起的的香蕉枯萎病。最初，该菌1号小种（Foc1）几乎导致‘大蜜哈’香蕉的毁灭，随着抗病品种Cavendish的发现和推广才使得香蕉产业重新复苏。然而，上世纪中后期，该菌4号小种（Foc4）的出现和蔓延，打破了这种局面，使香蕉产业重新面临极大的挑战。研究2个小种间致病性差异以及如何产生的致病性差异，将可能为香蕉枯萎病的防治提供新的理论基础。　　为了了解香蕉枯萎病菌两个小种在侵染‘巴西蕉’根系后的差异表达基因，本研究利用二代测序技术监测在Foc1和Foc4分别侵染‘巴西蕉’6 h、12 h、24 h和48 h的转录本活动，比较分析了两个小种侵染后的基因表达差异，从中筛选出果胶甲酯酶（pectin methylesterases，PME）基因，通过免疫荧光标记法进一步验证了该酶的变化趋势，并且通过基因克隆成功获得2个PME基因序列的相关信息。主要研究结果如下：　　1.利用数字表达谱技术分析和筛选Foc1和Foc4侵染‘巴西蕉’根系中差异表达基因。分别取Foc1和Foc4接种后0 h、6 h、12 h、24 h和48 h的‘巴西蕉’根系进行表达谱测序分析，并将0 h的测序结果作为对照，表达谱测序结果分析如下：‘巴西蕉’接种Foc1后6 h、12 h、24 h和48 h分别有2056、4835、6319和4703个基因显著上调，3096、3117、3692和3761基因显著下调；而‘巴西蕉’接种Foc4后6 h、12 h、24 h和48 h分别有2473、2649、3574和5014个基因显著上调，3593、2333、9613和3215个基因显著下调，这说明‘巴西蕉’接种Foc1后比Foc4能够更早的感知病原菌的入侵和诱导更强的防御反应。细胞壁合成相关酶基因、模式识别受体相关基因、转录因子WRKY22、WRKY33、TGA等抗病相关基因在Foc1侵染后的‘巴西蕉’中的上调水平显著高于Foc4，这表明这些基因参与香蕉抵抗病原菌侵染的防卫反应；调控过敏性坏死反应的基因CNGCs和Rboh在Foc4侵染后的植株中显著上调，在Foc1中变化则不明显，这也许是Foc4作为具有强致病力的腐生营养的重要手段；细胞壁降解酶PME、PG则是在Foc4中上调幅度更大，也表明Foc4能够更快地降解细胞壁，帮助病原菌入侵和定殖。本研究初步解释了‘巴西蕉’抗Foc1的机制，为进一步了解Foc1和Foc4产生致病差异的分子机制提供了一定的基础。　　2.果胶甲酯酶（PME）参与了植物抵抗病原菌的抗病反应。用化学法和免疫荧光标记法分别测定了Foc1和Foc4侵染‘巴西蕉’后PME的含量和果胶的甲酯化程度。化学法测定结果显示Foc1侵染后植株体内PME活性低于Foc4，且果胶甲酯化程度高于Foc4。利用免疫荧光标记法进一步观察发现，Foc1侵染的‘巴西蕉’具有高丰度的高甲酯化的果胶、相对较高的果胶总甲酯化程度以及较高的钙离子交联的果胶。这些结果或许是Foc1致病力降低的原因之一。　　3.寡聚半乳糖醛酸（OG）能够激发香蕉产生更强的抗性反应。利用OG纯品处理‘巴西蕉’后测定六个防卫相关基因的表达水平，活性氧的积累，胼胝质含量变化以及类黄酮含量的变化。本研究发现，OG、Foc1和Foc4均可以诱导防卫相关基因的表达水平，胼胝质含量以及类黄酮含量的上调， Foc1和Foc4可以诱导活性氧的产生且Foc4的诱导程度远远高于Foc1，但是OG不能够诱导活性氧的产生。此外，Foc1能够诱导的防卫相关基因的表达水平，胼胝质含量以及类黄酮含量的上调程度显著高于Foc4和OG。这说明Foc1能够诱导‘巴西蕉’产生更强的抗性反应，Foc4诱导的抗性反应则较弱，以及Foc4诱导的较强的活性氧含量可能是其作为致病力较强的腐生菌的重要手段。OG预处理后再接种Foc4的‘巴西蕉’诱导的抗性反应显著高于Foc4单独处理的植株，这说明OG确实可以诱导香蕉防卫反应，而且也说明OG含量或许是Foc两个小种存在致病差异的一个因素。　　4. 在Foc侵染‘巴西蕉’的过程也会释放大量的PME降解细胞壁。在本研究中首先分别克隆了 Foc1 和 Foc4 的两个 PME 基因并进行了相关的比较，本研究发现Foc1-g10008052和Foc4-g10004388的基因序列有16个核苷酸差异位点，导致了氨基酸序列中 1 个差异位点， 99.75%的氨基酸序列相似性， Foc1-g10006977 和Foc4-g10009887的基因序列有31个核苷酸差异位点，导致了氨基酸序列中9个差异位点，97.31%的氨基酸序列相似性。然后，利用荧光定量技术分别检测了葡萄糖、细胞壁提取物、无甲酯化的果胶和 55%-65%甲酯化的果胶分别处理 Foc1 和 Foc4 不同PME基因的表达情况，本研究的结果显示，在所有诱导物的诱导下，Foc4中PME基因上调的程度均显著高于Foc1，这说明Foc4中可能产生更多的PME以加速细胞壁的降解。

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