金针菇麦角硫因生物合成基因与G蛋白偶联受体基因的功能研究

摘要

金针菇营养丰富，美味可口，含有丰富的营养成分以及多种活性成分，具有预防癌症、高血压、缺血性心脏病、高血脂、糖尿病和胆结石等作用。麦角硫因是一种天然抗氧化剂，具有抗炎、抗氧化、保护细胞免受紫外损伤，保护心血管等作用，已被广泛应用于保健、食品、化妆品和药品中。金针菇中麦角硫因含量较为丰富，但生物合成途径仍然未知。　　近年来，我国金针菇工厂化发展迅速。近年来，我国工厂化金针菇年总产量增长20%左右。金针菇是一类低温结实型菌类，菌丝需经过低温诱导后才能形成原基并发育成子实体，这使得金针菇工厂化生产能耗大、成本高。G蛋白偶联受体是细胞膜上一类具有7个跨膜结构的蛋白受体家族。该类蛋白在真菌中参与着菌丝的生长、分化和子实体的形成。但目前对金针菇中该类蛋白的研究较少。　　因此，本文分别采用了体外酶促反应和体内基因编辑两种基因功能研究方法对金针菇麦角硫因生物合成基因和G蛋白偶联受体基因进行了研究，主要结果如下：　　（1）麦角硫因生物合成基因的表达及功能鉴定　　1）Fvegt1基因的表达及功能鉴定。本研究利用Blast p同源比对获得了金针菇麦角硫因生物合成基因Fvegt1，重叠衍生PCR克隆了该基因并在大肠杆菌BL21 (DE3)中表达后获得了重组酶FvEgt1。HPLC和ESI-MS分析结果表明：重组酶FvEgt1能将组氨酸、半胱氨酸和S腺苷甲硫氨酸等底物催化形成S腺苷L高半胱氨酸和组氨酸甜菜碱半胱氨酸亚砜。本研究首次定义了金针菇中Fvegt1基因的功能，该基因表达的重组酶FvEgt1不仅具有甲基转移酶的功能，还具有亚砜合酶的功能。　　2）Fvegt2和Fvegt3基因的表达及功能鉴定。本研究利用Blast p同源比对获得了金针菇麦角硫因生物合成基因Fvegt2和Fvegt3，采用全基因合成克隆后在大肠杆菌BL21 (DE3)中异源表达，获得了重组酶FvEgt2和FvEgt3。HPLC和ESI-MS分析结果表明，重组酶FvEgt2和FvEgt2能共同催化组氨酸甜菜碱半胱氨酸亚砜形成麦角硫因。本研究首次建立了除细菌、子囊菌等以外的担子菌金针菇中麦角硫因的生物合成途径。　　3）FvEgt2和FvEgt3作用机制的研究。本研究首次发现了金针菇中存在的两种半胱氨酸脱硫酶，即FvEgt2，半胱氨酸-半胱氨酸脱硫酶和FvEgt3，磷酸吡哆醛-半胱氨酸脱硫酶。这两种酶共同参与着麦角硫因的生成。其中，FvEgt2能与半胱氨酸结合，激活半胱氨酸的SH形成硫阴离子。而FvEgt3则催化磷酸吡哆醛与组氨酸甜菜碱半胱氨酸亚砜形成酮亚胺复合物。前者活化的硫阴离子亲核攻击酮亚胺复合物后便可形成麦角硫因。　　（2）获得了假定G蛋白偶联受体基因。通过氨基酸同源比对（Blast P）以及金针菇冷诱导前后菌丝阶段和原基阶段的转录组数据分析，获得了金针菇中的两个假定G蛋白偶联受体基因Fvgpcr1, Fvgpcr2。其中，Fvgpcr1在原基阶段的表达量较菌丝阶段上调，而Fvgpcr2表达量却呈现下调趋势。　　（3）构建了CRISPR/Cas9敲除载体。利用酶切连接的方法构建了4个含有hph、sgRNA和Fvcas9的CRISPR/Cas9敲除载体：pCAMBIA0390-hph-Fvcas9-Fvgpcr1-sgRNA1、pCAMBIA0390-hph-Fvcas9-Fvgpcr1-sgRNA2、pCAMBIA0390-hph-Fvcas9-Fvgpcr2-sgRNA1、pCAMBIA0390-hph-Fvcas9-Fvgpcr2-sgRNA2。　　（4）优化了农杆菌介导金针菇遗传转化的体系。本研究首次利用金针菇菌丝球培养液作为转化受体进行转化，获得了大量能稳定遗传的转化子。　　（5）含FvCas9蛋白的金针菇菌株的获得。利用农杆菌介导遗传转化法将4个CRISPR/Cas9敲除载体转入金针菇中，通过潮霉素筛选和PCR鉴定后获得了靶向Fvgpcr1的转化子13个，靶向Fvgpcr2的转化子33个。靶向突变位点测序结果表明：目标位点未发生突变。RT-qPCR和Western blot结果表明：Fvcas9基因已成功整合至金针菇基因组中，并能正常转录翻译折叠成FvCas9蛋白。本研究获得了能稳定表达FvCas9蛋白的金针菇菌株。

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