稻瘟病菌麦角甾醇生物合成途径和cAMP-PKA信号途径致病相关基因功能研究

摘要

稻瘟病菌（Magnaporthe oryzae）引起的稻瘟病（rice blast disease）是世界水稻产区最重要的病害之一。由于该病的经济和社会重要性，以及稻瘟病菌在培养和遗传上的可操作性，稻瘟病菌已逐渐成为研究丝状真菌分子生物学和致病机理的模式真菌。尽管如此，对稻瘟病菌的致病分子机理仍不够清楚，本文主要研究了麦角甾醇生物合成途径的关键酶和cAMP-PKA信号途径下游转录调节子在稻瘟病菌形态分化和致病过程中的作用，取得以下结果:
　　 1.MoCYP51A在稻瘟病菌产孢、致病以及在对DMI类药剂的敏感性中起重要作用。
　　 麦角甾醇调控细胞膜的流动性和渗透性，是真菌细胞生存所必需的，而甾醇14-α去甲基化酶(Cyp51)则是甾醇合成途径中的关键酶。生物信息学分析发现，稻瘟病菌基因组中含有2个与酵母CYP51(ERG11)同源的基因MoCYP51A和MoCYP51B，分别编码假定的14-α去甲基化酶。MoCYP51A基因的缺失突变体（△mocyp51A）的营养生长和菌落形态与野生菌株Guy11没有明显差异，但产孢和致病力均下降。然而，MoC YP51B基因缺失突变体（△mocyp51B）的表型与Guy11类似。实验表明，△mocyp51A突变体对甾醇去甲基化抑制剂类(DMI)的杀菌剂高度敏感，而△mocyp51B突变体对该类杀菌剂的敏感性没有明显变化。外源添加DMI类的杀菌剂能明显诱导MoCYP51A和MoCYP51B的表达。进一步细胞内蛋白定位分析发现，MoCyp51A主要定位于菌丝和分生孢子的细胞质中。当用DMI类杀菌剂诱导处理时融合蛋白MoCyp51A-GFP的表达量明显增高，且荧光主要出现在液泡中，这与用强启动子过表达MoCYP51A-GFP的结果一致。上述结果表明，MoCYP51A对稻瘟病菌的产孢、致病力和对DMI类药剂的敏感性起重要作用。此外，稻瘟病菌基因组中含有3个与酵母ERG6（编码24-C-甲基转移酶）同源的基因，分别为24 C-S MTA、24C-SMTB和24C-SMTC。实验证明，这些基因的单基因缺失突变体的形态、致病性等表型没有明显变化。实验还发现，融合蛋白24C-SmtA-GFP表达量很高，荧光出现在液泡内及各种膜结构上。
　　 2.通过筛选稻瘟病菌T-DNA插入突变库，鉴定了2个新的致病相关基因:MoSOM1和MoCDTF1。
　　 为了发掘新的致病相关基因，更深入的了解稻瘟病菌与寄主植物互作的机制，我们建立了T-DNA插入突变体库，从中筛选有致病缺陷的突变体，鉴定相关的突变基因。通过大规模的插入突变体库筛选，得到5个有致病缺陷的稻瘟病菌突变体，成功获得了T-DNA插入位点的侧翼基因组DNA序列信息，并从中鉴定了2个新的稻瘟病菌致病相关基因:MoSOM1和MoCDTF1。基因敲除和互补实验表明，它们在稻瘟病菌产孢、附着胞形成、细胞壁分化、黑色素沉积和细胞表面疏水性等方面起着关键作用。△mosom1和△mocdtf1突变体均不能产生分生孢子、子囊和子囊孢子，菌丝经诱导后也不能形成附着胞，同时丧失对感病大麦和水稻叶片的致病能力。此外，△mosom1和△mocdtf1突变体的生长速度不同程度地减慢、黑色素减少、表面疏水性显著降低，尤以前者的表型改变更为显著。
　　 3.MoSom1分别与MoCdtf1和APSES转录因子MoStu1互作，作用于cAMP-PKA信号途径下游，调控稻瘟病菌形态分化和致病性。
　　 酵母双杂交实验表明，MoSom1分别与MoCdtf1和APSES转录因子MoStu1(Mstu1)有很强的互作。在酿酒酵母中，Flo8是cAMP-PKA信号途径的转录因子，直接作用于PKA的催化亚基Tpk2(CpkA)的下游，有趣的是，在外加cAMP的条件下，稻瘟病菌MoSom1与CpkA也有微弱的互作。进一步的研究发现，尽管MoSom1与酿酒酵母Flo8的氨基酸同源性很低，但MoSOM1基因可以互补酿酒酵母flo8突变体的表型缺陷，使其恢复单倍体阶段的侵染（侵入培养基）生长和二倍体阶段的假菌丝生长。另外，qRT-PCR分析表明，在△mac1和△cpkA突变体中MoSOM1和MoCDTF1的表达水平显著降低。上述实验结果充分证明MoSom1与MoCdtf1和APSES的转录因子MoStu1互作，作用于cAMP-PKA信号途径下游。
　　 4.MoSom1与MoCdtf1的结构域对其功能至关重要，而且赤霉病菌基因FgSOM1可以互补△mosom1突变体的表型缺陷。
　　 GFP融合蛋白MoSom1-GFP和MoCdtf1-GFP都定位于稻瘟病菌细胞核中。点突变实验证实了MoSom1和MoCdtf1中的核定位信号对于蛋白的亚细胞定位及生物学功能起着重要作用。与酵母转录因子Flo8类似，MoSom1也含有LisH结构域，而MoCdtf1则含有一个ZnF_ C2H2结构域，实验证明这些结构域不仅与蛋白生物学功能有关，而且还可影响蛋白的细胞核定位。另外，通过转录表达谱分析发现，MoSOM1基因的缺失可导致多个致病相关基因（如MPG1、COS1、MoRIC8、MAC1、CPKA）表达水平的变化。另外，本研究还发现赤霉病菌的MoSOM1同源基因(FgSOM1)可以互补△mosom1突变体的各种表型缺陷，说明在植物病原真菌中MoSOM1同源基因可能是功能保守且十分重要的。

目录

声明

论文说明

致谢

摘要

缩略词

第一章 文献综述

1 稻瘟病与稻瘟病菌

2 麦角甾醇生物合成途径研究进展

3 稻瘟病菌信号途径研究进展

3．1 cAMP-PKA信号途径研究进展

3．2 MAPK信号途径研究现状

3．3 Ca2+信号途径

4 稻瘟病菌产孢相关基因研究进展

5 稻瘟病菌其它致病相关基因研究进展

5．1 识别寄主表面的相关基因

5．2 黑色素合成相关基因

5．3 甘油合成相关基因

5．4 SNARE蛋白有关研究

5．5 细胞自噬基因

5．6 几丁质合成酶基因研究进展

6 农杆菌介导的稻瘟病菌T-DNA插入突变研究概述

7 本研究的目的与意义

第二章 材料与方法

1 实验材料

1．1 供试菌株

1．2 质粒载体

1．3 供试植物

1．4 试剂

1．5 培养基

1．6 缓冲液

2 DNA和RNA的操作

2．1 稻瘟病菌基因组的提取

2．2 质粒操作

2．3 PCR反应和质粒转化

2．4 农杆菌介导的T-DNA转化

2．5 稻瘟病菌原生质体的制备与转化

2．6 稻瘟病菌基因组Southern杂交方法

2．7 酵母实验方法

2．8 稻瘟病菌性状观察实验

2．9 稻瘟病菌染色实验

第三章 稻瘟病菌甾醇合成途径相关基因功能研究

1 稻瘟病菌甾醇14-α去甲基化酶编码基因的系统进化发育分析

2 MoCYP51A和MoCYP51B基因功能研究

2．1 MoCYP51A和MoCYP51B的基因缺失载体构建

2．2 突变体△mocyp51A和△mocyp51B的获得

2．3 MoCYP51A基因与稻瘟病菌产孢和致病性有关

2．4 MoCYP51B基因的缺失诱导MoCYP51A基因的高表达

2．5 MoCYP51A基因的缺失导致稻瘟病菌对DMI类杀菌剂的敏感性增强

2．6 MoCYP51A基因在菌丝生长、产孢和附着胞形成过程中低水平表达

2．7 在突变体△mocyp51A中过表达MoCYP51B基因不能恢复对DMI类药剂的敏感性

2．8 编码甾醇-24C-甲基转移酶基因功能初步研究

3 本章小结

第四章 cAMP-PKA途径下游两个新的转录调节子MoSom1和MoCdtf1的功能研究

1 稻瘟菌ATMT转化子库的建立及致病缺陷突变体的获得

2 稻瘟菌致病缺陷突变体T-DNA插入位置的鉴定

3 两个新的转录调节子MoSom1和MoCdtf1的功能研究

3．1 MoSOM1和MoCDTF1基因缺失突变体的获得

3．2 MoSom1和MoCdtf1蛋白定位于细胞核

3．3 MoSOM1和MoCDTF1基因在稻瘟病菌侵染寄主植物中起重要作用

3．4 MoSOM1和MoCDTF1基因影响稻瘟病菌的营养生长和色素沉积

3．5 突变体△mosom1和△mocdtf1不能产生分生孢子

3．6 MoSOM1和MoCDTF1基因是影响有性生殖的关键因子

3．7 MoSOM1和MoCDTF1基因在附着胞的形成中起重要作用

3．8 MoSOM1和MoCDTF1基因在菌落的疏水性中起关键作用

3．9 MoSOM1基因转录后不同的剪切方式

3．10 MoSOM1和MoCDTF1基因受cAMP-PKA途径调控

3．11 MoSOM1基因可对酿酒酵母flo8突变体功能互补

4 赤霉病菌基因FgSOM1在稻瘟病菌突变体△mosom1中的异源互补

4．1 赤霉病菌基因FgSOM1表达载体的构建

4．2 表达赤霉病菌基因FgSOM1的稻瘟病菌菌株的获得和鉴定

4．3 FgSOM1在稻瘟病菌中的功能分析

5 核定位信号和保守结构域的鉴定及功能研究

5．1 核定位信号的鉴定及功能研究

5．2 MoSom1中LisH(Lissencephaly type 1-like homology)结构域和MoCdtf1中Zn-finger结构域的功能鉴定

6 稻瘟病菌中与MoSOM1相关基因的功能研究

6．1 MoSOM1与MoSFL1基因关系研究

6．2 MST12在突变体△mosom1中的过表达实验

6．3 MGG_13557和MGG_08829基因功能的初步研究

7 稻瘟病菌中其它含有LisH结构域的基因功能初步研究

7．1 稻瘟病菌含有LisH结构域基因的预测

7．2 含有LisH结构域基因的缺失实验

8 稻瘟病菌突变体△mosom1的表达谱分析

9 其它T-DNA插入突变体的研究

9．1 突变体YX-864中T-DNA插入基因MoMSB2的功能研究

9．2 突变体TDNA-672中T-DNA标记基因MoMET13的功能研究

10 本章小结

第五章 全文讨论及后续研究展望

1 全文讨论

1．1 MoCYP51A在介导稻瘟病菌对DMI类药剂敏感性以及产孢和致病过程中起重要作用

1．2 cAMP-PKA途径下游的转录调节子MoSom1和MoCdtf1在稻瘟病菌致病相关形态发育和致病过程中起关键作用

1．3 稻瘟病菌cAMP-PKA信号途径的模式图

2 后续研究展望

参考文献

附录

攻读博士学位期间已发表的研究论文