小麦赤霉病菌麦角甾醇生物合成途径中关键基因的功能研究

摘要

麦角甾醇是真菌细胞质膜的组分，在维持真菌细胞膜的流动性、完整性以及膜上的一些蛋白功能的正常行使等方面起到了非常重要的作用。麦角甾醇生物合成途径以乙酰辅酶A为原料，经过20多步的反应形成麦角甾醇。目前已成功开发出多种麦角甾醇生物合成抑制剂（以下简称为SBIs），在临床和农业生产上得到了广泛的应用。目前对于模式生物酿酒酵母中麦角甾醇生物合成途径的的研究报道较多，但是对丝状真菌中该合成途径的研究甚少。因此，研究小麦赤霉病菌中麦角甾醇途径各元件的功能对于进一步阐明SBIs的抗药机制以及发掘该途径上其它潜在的药剂靶标具有重要的理论和现实意义。
　　 本研究通过基因敲除和互补的方法研究了小麦赤霉病菌麦角甾醇生物合成途径上21个ERG基因的生物学功能，并对该菌中麦角甾醇合成途径的调控元件进行了初步探索，结果发现:
　　 1、编码甾醇14-α脱甲基酶（DMI类杀菌剂的作用靶标）的3个同源的cyp51基因都并非小麦赤霉病菌生长和麦角甾醇生物合成所必需。敲除突变体对7种DMI类杀菌剂敏感性水平与野生型菌株相比不一，cyp51A基因敲除突变体对7种DMI类杀菌剂都变敏感;cyp51B基因敲除突变体对7种DMI类杀菌剂的敏感性没有显著变化;cyp51C基因敲除突变体对部分DMI类杀菌剂变敏感。将戊唑醇和三唑酮进行复配对防治小麦赤霉病表现出明显的增效作用。
　　 2、编码甾醇C-14还原酶（胺类杀菌剂的作用靶标）的2个FgERG24基因和编码甾醇C-8异构酶（胺类杀菌剂的作用靶标）的FgERG2基因也都并非小麦赤霉病菌生长和麦角甾醇生物合成必需。FgERG24B基因介导小麦赤霉病菌对胺类杀菌剂的天然抗药性，该基因缺失后突变体对3种胺类杀菌剂的抗药性水平明显降低，FgERG24A和FgERG2基因敲除突变体对胺类杀菌剂的抗药性水平与野生型菌株相当。
　　 3、编码甾醇C-24还原酶的FgERG4基因缺失并不致死，但敲除突变体与野生型菌株相比会发生一系列的表型变化:不能正常合成麦角甾醇、菌丝生长缓慢、分生孢子产量降低、分生孢子畸形且分隔数减少、在麦穗上的致病性显著降低、DON毒素合成量降低、对金属离子和细胞渗透及氧化压力变得敏感和对SBIs抗药性水平上升。
　　 4、麦角甾醇生物合成途径中角鲨烯下游的其它的14个ERG基因有8个敲除可能致死，推测对小麦赤霉病菌的生长非常重要。还有6个ERG基因获得了敲除突变体，但表型测定结果显示与野生型菌株没有明显的差异。
　　 5、根据酿酒酵母、白色念珠菌和烟曲霉中关于麦角甾醇生物合成途径调控元件的相关研究报道，结合小麦赤霉赤霉病菌受DMI类药剂戌唑醇处理6h后的基因组表达谱数据，在小麦赤霉病菌基因组中找到了18个可能的麦角甾醇生物合成调控基因，其中仅有一个基因敲除可能致死，其他的17个基因都获得了敲除突变体。转录调控因子FgSTE12的敲除突变体在菌落形态、产孢等方面与野生型菌株相比没有显著差异，但是在麦穗上的致病力完全丧失;但是并未发现与DMI类杀菌剂的敏感性和cyp51基因或ERG基因的表达量水平相关的调控基因。
　　 本研究结果表明1）小麦赤霉病菌对SBIs的抗药性机制与其他真菌有明显差异:不同的DMI药剂作用于不同的CYP51;FgErg24B调控小麦赤霉病菌对胺类杀菌剂的天然抗药性。2）小麦赤霉病菌麦角甾醇生物合成相关基因FgERG4参与小麦赤霉病菌的致病性、DON毒素合成和产孢等多种重要生理活动;8个敲除可能致死的ERG基因推测为小麦赤霉病菌生长必需的重要基因，它们可能成为潜在的杀菌剂新药靶。

目录

声明

致谢

摘要

引言

第一章 文献综述

1 小麦赤霉病研究进展

1．1 小麦赤霉病概况

1．2 小麦赤霉病菌的基本生物学特性

1．3 禾谷镰孢菌功能基因组学研究进展

2 小麦赤霉病的防控策略

2．1 小麦赤霉病的防控策略概况

2．2 小麦赤霉病化学防治中三大类药剂抗药机制研究进展

3 麦角甾醇生物合成和调控

3．1 酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)中麦角甾醇生物合成途径

3．2 丝状真菌中麦角甾醇生物合成途径

3．3 麦角甾醇生物合成途径的调控

4 小麦赤霉病菌研究的分子生物学方法

4．1 小麦赤霉病菌基因功能研究方法

4．2 小麦赤霉病菌遗传转化体系

5 本研究的目的和内容

第二章 材料与方法

1 试验材料

1．1 菌株和质粒

1．2 供试植物

2 试验方法

2．1 小麦赤霉菌种的保存、培养、产孢

2．2 小麦赤霉病菌基因组DNA的提取

2．3 PCR技术

2．4 DNA琼脂糖电泳

2．5 PCR产物纯化

2．6 大肠杆菌E．Coli DH5a菌株感受态细胞的制备

2．7 DNA克隆技术

2．8 重组质粒的鉴定与提取

2．9 质粒酶切

2．10 小麦赤霉病菌基因敲除载体的构建及转化子的获得与鉴定

2．11 小麦赤霉病菌基因互补载体的构建及转化子的获得与验证

2．12 小麦赤霉病菌的遗传转化方法

2．13 小麦赤霉病菌基因组DNA Southern blot分析

2．14 小麦赤霉病菌总RNA的提取与基因表达量分析

2．15 基因组表达谱solexa测序

2．16 生长速率测定

2．17 产孢量分析和孢子染色

2．18 小麦赤霉病菌对细胞胁迫压力、杀菌剂敏感性的测定

2．19 小麦赤霉菌株对戊唑醇、咪酰胺的EC50值测定

2．20 三唑酮和戊唑醇复配防治小麦赤霉病的药效试验

2．21 小麦赤霉病菌致病性分析

2．22 小麦赤霉病菌DON毒素含量测定

2．23 小麦赤霉病菌麦角甾醇和总甾醇测定

2．24 酿酒酵母互补实验

第三章 结果与分析

1 小麦赤霉病菌3个同源的cyp51基因的功能研究

1．1 小麦赤霉病菌对戊唑醇、咪酰胺的敏感性测定

1．2 小麦赤霉DMI-R和DMI-S菌株的CYP51氨基酸序列分析和cyp51基因表达量测定

1．3 小麦赤霉病菌受戊唑醇处理6h基因组表达谱分析

1．4 小麦赤霉病菌3个同源cyp51基因的克隆和序列分析

1．5 3个同源cyp51基因敲除突变体和互补突变体的获得

1．6 突变体表型分析

1．7 三唑酮和戊唑醇对小麦赤霉病菌防治增效作用的测定

1．8 小结与讨论

2 小麦赤霉病菌FgERG24A／B和FgERG2基因的功能研究

2．1 小麦赤霉病菌对十三吗啉、苯锈啶和螺环茵胺的敏感性测定

2．2 小麦赤霉病菌FgERG24A／B和FgERG2基因的分离和序列分析

2．3 FgERG24A／B和FgERG2基因敲除突变体和互补突变体的获得

2．4 突变体表型分析

2．5 小结与讨论

3 小麦赤霉病菌FgERG4基因的功能研究

3．1 小麦赤霉病菌FgERG4基因的分离和序列分析

3．2 小麦赤霉病菌FgERG4基因敲除载体的构建

3．3 小麦赤霉病菌FgERG4基因敲除突变体的获得和鉴定

3．4 小麦赤霉病菌FgERG4基因的互补

3．5 突变体表型分析

3．6 小结与讨论

4 小麦赤霉病菌麦角甾醇生物合成途径其他14个ERG基因功能研究

5 小麦赤霉病菌麦角甾醇生物合成调控元件的分离鉴定和功能研究

5．1 麦角甾醇吸收调控转录因子upc2和ecm22分离鉴定和功能研究

5．2 SREBP途径相关元件的分离鉴定和功能研究

5．3 其他可能的甾醇平衡转录调控因子的分离鉴定和功能研究

5．4 小结与讨论

第四章 全文结果和后续工作展望

1 全文结果

2 后续工作展望

参考文献

附录

附录A：引物序列

附录B：培养基配方、常用试剂和试验仪器

附录C：个人简历和博士期间发表的学术论文