人工蜂粮发酵条件的优化及质量控制要求

摘要

本文通过对天然蜂粮进行研究分析，从天然玉米蜂粮中分离出微生物，并确定人工蜂粮发酵的菌种为从天然蜂粮中分离出的优势乳酸菌，对小型中试（30L）发酵罐进行人工蜂粮的发酵参数的优化，且对人工蜂粮进行了毒理性实验，对比分析了花粉、天然蜂粮和人工蜂粮中的部分营养成分，制定出人工蜂粮的质量标准体系。主要实验结果如下：　　（1）从天然玉米蜂粮种分离了 12 种微生物，分别是红曲霉菌 Aspergillus versicolor；红酵母属Rhodotorula；米曲霉Aspergillus oryzae；布氏乳杆菌Lactobacillus buchneri；干酪乳杆菌鼠李糖亚种Lactobacillus rhamnosus；嗜酸乳杆菌Lactobacillus acidophilus；植物乳杆菌Lactobacillus Plantarum；乳酸球菌Lactococcus garvieae以及巨大芽孢杆菌Bacillus megaterium。　　（2）对7株乳酸菌进行产酸能力和抑菌活性测试，结果显示菌H的产酸活性最强。细菌的抑菌活性的测定结果为：7株乳酸菌均可以抑制金黄色葡萄球菌，除了菌F之外的乳酸菌可以对大肠杆菌产生抑制作用，仅有菌G会对枯草芽孢杆菌产生抑制作用。乳酸菌对真菌的抑制结果为：菌F、G、H、L均可抑制啤酒酵母，菌E、F、H、J均可抑制假丝酵母。综合乳酸菌的产酸能力和抑菌活性的结果，将人工蜂粮发酵使用的菌种定为均能H。　　（3）以人工蜂粮的乳酸菌活菌数和感官评分作为评价指标，对人工蜂粮小型中试（30L）发酵罐的发酵参数进行优化。选取的因素为料液比（m/v）、乳酸菌接种量（v/v）、发酵温度（℃）和搅拌转速（r/min）进行单因素实验后基于响应面法进行分析。利用Design-Expert 8.0.6软件联合对回归方程进行求解后结合实际操作水平进行人工蜂粮液态发酵参数的确定，得到的最优发酵参数如下：料液比（m/v）为 13%，乳酸菌接种量（v/v）为 10%，发酵温度为 33℃，发酵罐的搅拌转速为445r/min。　　（4）对人工蜂粮进行毒理性试验。急性毒性实验中，未观察到小鼠出现明显的异常行为和体征和死亡现象，所有实验组的半致死量都大于 10.00g/kg?BW，这满足保健品的实际无毒范围的标准；小鼠一次最大耐受量实验中，对小鼠进行相当于人体剂量的119倍灌胃后未发现死亡现象，说明人工蜂粮作为保健品是安全的；28 天喂养大鼠实验中，实验组设置低、中、高剂量组，三个实验组的剂量分别与人体推荐食用量的 10 倍、50 倍以及 100 倍对应，实验期间大鼠体征和行为都正常，也无死亡现象，且发现人工蜂粮对于大鼠体重的增长具有轻微的促进作用，对大鼠的血液生化指标进行分析发现人工蜂粮对大鼠血液生化指标未产生显著影响，各实验组与对照大鼠的生化检查均在正常参考值的范围内，对大鼠大体解剖发现人工蜂粮对大鼠的胃肠、睾丸、卵巢等均无明显的负面影响。　　（5）对花粉、天然蜂粮以及人工蜂粮进行了总糖、粗脂肪、总蛋白以及氨基酸含量的测定，测定结果表明，蜂粮的各个营养成分相比于花粉都有明显增多，且人工发酵蜂粮的营养成分高于天然蜂粮，具体结果为：人工蜂粮中总糖含量为46.8%，粗脂肪含量为5.12%，粗蛋白含量为24.3%，总氨基酸含量为12.952/100g。结果证明人工发酵蜂粮具有较高的营养价值。　　（6）提出了人工蜂粮的质量控制要求，对人工蜂粮的原辅料要求、环境设施、功效成分、感官指标、营养指标、卫生指标、实验方法以及检验规则都提出了控制要求。

目录

1 绪 论

1.1.1保健品

1.1.2保健品的分类

1.1.3 发展保健品的必然性

1.2花粉及其研究进展

1.3蜂粮（Bee Bread）及其研究进展

①目前国内外蜂粮研究现状

②蜂粮中的微生物

1.4乳酸菌

1.5蜂粮发酵过程

1.5.1天然蜂粮的发酵

1.5.2人工发酵蜂粮的生产技术

1.6.1 研究目的

1.6.2 研究意义

1.7.1 研究内容

1.7.2 技术路线

1.8本文创新点

2 蜂粮中的微生物的分离与分子生物学鉴定

2.1 实验材料

2.2.1培养基

2.2.2 主要试剂

2.2.3 所需的配制试剂

2.3 实验仪器

2.4 实验方法

2.4.1天然蜂粮中菌种的分离

2.4.2 菌落的纯化

2.4.3菌种的扩大培养

2.4.3 菌种的保存

2.4.4 菌种的鉴定

2.5.1 菌群分离结果

2.5.2 基因组提取

2.5.3 PCR扩增

2.5.4 测序结果

2.6 本章小结

3 优良发酵性能菌种的筛选

3.1实验材料

3.2实验试剂

3.3实验仪器

3.4.1活化菌株

3.4.2乳酸菌产酸能力的测定

3.4.3乳酸菌抑菌活性的比较

3.4.4菌株的性能测定

3.5.1 乳酸菌产酸能力的测定

3.5.2 乳酸菌抑菌活性的比较

3.5.3 菌株性能测定

3.6 本章小结

4 蜂粮液态发酵条件的优化

4.1.1材料和设备

4.1.2实验方法

4.2结果与分析

4.2.1料液比对发酵结果的影响

4.2.2乳酸菌接种量（%）对发酵的影响

4.2.3发酵温度（℃）对发酵的影响

4.2.4搅拌转速对发酵的影响

4.2.5响应面法优化发酵条件

4.3对软件优化的工艺参数进行验证和分析

4.4本章小结

5 毒理性实验

5.1实验材料、条件与预处理

5.2实验设备

5.3实验方法

5.3.1小鼠急性经口毒性实验

5.3.2一次最大耐受量实验

5.3.3人工蜂粮作为保健品的28天喂养实验

5.4.1小鼠急性经口实验

5.4.2小鼠一次最大耐受量结果

5.4.3 人工蜂粮28天喂养大鼠实验结果

5.5本章小结

6 人工蜂粮与天然蜂粮、花粉的营养成分比较

6.1试验试剂

6.2实验仪器

6.3 实验方法

6.3.1 总糖含量的测定

6.3.2粗脂肪含量的测定：索氏抽提法

6.3.4氨基酸含量的测定

6.4实验结果

6.4.1总糖含量的对比

6.4.2粗脂肪含量的对比

6.4.3总蛋白含量的对比

6.4.4氨基酸含量对比

6.5结论

7 人工蜂粮的质量控制要求

7.1人工蜂粮产品的剂型选择

7.2人工蜂粮产品的质量要求

7.3人工蜂粮产品的质量标准

7.3.1范围

7.3.2规范性引用文件

7.3.3 术语和定义

7.3.4人工蜂粮原料与辅料要求

7.3.5环境与设施要求

7.3.6质量要求

7.3.7实验方法

7.3.8检验规则

7.3.9 标志、标签、包装、运输、贮存

7.4小结

8 总结和展望

8.1总结

8.2 展望

参考文献

附录

A. 作者在攻读学位期间已录用未发表的论文目录

B. 学位论文数据集

致谢