大肠杆菌噬菌体LSB-1裂解酶基因gp17的表达、抗菌效应分析及优化设计预测

摘要

自噬菌体被发现以来便广发被用于抗菌相关研究。但是自弗莱明于1928年意外发现青霉素作为抗菌药物以后,由于抗生素治疗效果显著,且噬菌体研究不够成熟,利用噬菌体进行抗菌一直处于搁置状态。2001年Nelson等通过重组表达获得了纯化的噬菌体裂解酶并将其作为抗菌物质进行研究。近年来,随着耐药菌的广泛产生以及环境保护面临严峻压力,以及抗生素的研发周期远长于细菌对该物质产生耐药的周期,对噬菌体抗菌功能的探索及应用产品的开发逐渐成为医学研究热点之一。噬菌体的天然抗菌效应和通过分子生物学技术人工修饰的改良产物表现特色给环境净化、水体净化、食物安全及临床抗菌应用开辟了新的发展方向。2013年欧洲还成立了PhagoBurn项目专门用于研究噬菌体治疗烧伤后大肠杆菌和绿脓杆菌感染问题。　　噬菌体作为细菌病毒,能够特异性识别和裂解细菌,其灭菌效应被越来越多的研究者关注。噬菌体裂解酶作为噬菌体在进入细菌之前溶解细胞壁以及在宿主体内繁殖之后裂解细菌、释放子代噬菌体的关键酶,现正受到越来越多的研究者的重视并对其进行进一步研究。　　本教研室在医院的污水池中分离到一株大肠杆菌噬菌体并将其命名为LSB-1,初步研究发现了该噬菌体裂解细菌的相关酶基因gp17,并对其进行测序后提交至GenBank(GenBank序列号:KC425724.1)。本研究通过原核表达技术将唾液酸酶基因克隆到质粒pET300构建重组质粒pET300-gp17,然后再将重组质粒转化到大肠杆菌BL21(DE3)进行诱导表达,并对表达的蛋白进行纯化,最终获得了gp17基因表达的纯化蛋白。采用KB纸片法对纯化重组蛋白的有效菌谱进行测定,并将测定结果与通过噬菌体展示技术将gp17基因重组到T7噬菌体得到的T7-LSB-gp17重组噬菌体的有效菌谱进行比较,并对其结果进行分析。为了进一步提高酶活性,拟对gp17唾液酸酶的关键氨基酸进行突变以增强其活性,并用AutoDock分子对接软件对替换后的蛋白和唾液酸进行对接以查看替换后蛋白和唾液酸的结合效果。研究内容和结果如下:　　1.唾液酸酶基因的克隆、表达和纯化:利用基因重组技术将EIEC8401噬菌体LSB-1裂解酶基因gp17构建到表达载体质粒pET300中,并在大肠杆菌BL21(DE3)中诱导表达及纯化,最终获得了gp17基因通过重组成功表达出分子量为78kDa的溶解蛋白;利用BCA法测定纯化重组蛋白的含量,纯化后浓度为2.38mg/ml。　　2.利用抑菌实验检测重组蛋白的抑菌活性:以大肠杆菌、葡萄球菌等多种细菌等为试验菌采用Kirby-Bauer纸片法对重组噬菌体唾液酸酶的有效作用菌谱进行测定,发现重组噬菌体酶对噬菌体宿主菌EIEC8401有良好的抑菌作用,经过5小时的培养能够见到直径约为2cm、明显的抑菌圈,对其他种类的细菌无明显抑菌作用,显示该噬菌体酶具有高度特异性,这种特异性与T7噬菌体展示技术产物(重组噬菌体T7-LSB-gp17较宽的宿主谱)不同。　　3.采用结构域单独表达法与非保守位点突变法为理论依据设计突变体,通过AutoDock软件分析,结果发现将结构域直接进行表达(突变体2)以及非保守位点124位(突变体6)和167位(突变体7)的天冬酰胺改变为丝氨酸获得的突变体进行表达获得突变体具有结合能更低、与底物结合能力更强。用信息技术对突变体进行显示了生物信息学差异。　　综上所述,本研究将噬菌体裂解细菌的唾液酸酶进行克隆、表达和纯化获得目的蛋白,进行体外活性检测发现其对EIEC8401有较好的特异性,其结果与通过噬菌体展示技术获得的重组噬菌体T7-LSB-gp17有较大的差异;通过对酶的相关位点进行突变,获得了一系列突变株,采用AutoDock进行对接,预测显示将结构域直接进行表达(突变体2)以及非保守位点124位(突变体6)和167位(突变体7)的天冬酰胺改变为丝氨酸获得的突变体具有较原蛋白更好的结合能力,通过分析认为其活性增加是由于其结构改变引起的,可以进行下一步实验进行验证。本研究的结果为进一步研究该唾液酸酶的功能、机制等方面奠定了一定的基础。

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第一章 前 言

第二章 大肠杆菌噬菌体LSB-1裂解酶基因gp17的表达与纯化

2.1 重组质粒pET300-gp17的构建及表达

2.2 噬菌体裂解酶重组蛋白的纯化

第三章 重组裂解酶抗菌效应初步研究

3.1 材料与方法

3.2 结果

3.3 讨论

第四章 gp17基因蛋白活性优化设计预测分析

4.1 材料与方法

4.2 结果

4.3 讨论

参考文献

致谢