金福菇多糖TLH-3提取分离以及抗氧化活性片段筛选

摘要

金福菇(Trichloma lobayense Heim)又名大白口蘑，属担子菌亚门层菌纲伞菌属口蘑科（白蘑科）。金福菇具有很高的营养和药用价值。随着科技的进步，在细胞水平上的研究发现这些价值主要体现在于含量颇丰的多糖。在人们不断的追求健康的理念下，真菌多糖由于其药用价值一直以来备受人们关注。据分析，每公斤干品中含蛋白质27.56％、总糖38.44％、粗脂肪9.58％、粗纤维8.20％。了解这些成分如何影响细胞的生理活性，才能为我们的膳食理念和食品科学及其他领域提供药理学基础。目前为止，关于金福菇的研究极少且主要集中于其培养优化和简单的研究其营养组成。值得注意的是，至今还没有对金福菇多糖进行较系统的研究。尽管许多研究表明真菌多糖具有许多的生物化学活性，但其空间结构及其构效如何影响其功能仍不清楚。因此，我们主要在细胞模型上研究其空间结构及其构效与其相应的药理学之间的关系，从而为我们人类的日常膳食提供一定的理论参考。本实验对其进行提取分离纯化后，得到三组分，对金福菇多糖进行的抗氧化性质分析，对比三组分的抗氧化能力，筛选出最优部分，同时对其进行降解和分析，并且对多糖构象做了一些初步分析。具体如下:
　　首先，利用传统的水提醇沉方法和sevag除蛋白的方法，得到金福菇多糖。然后联合利用阴离子交换法和凝胶过滤法得到TLH-1、TLH-2和TLH-3三种组分。通过对这三种多糖进行总糖的测定、蛋白测定、全紫外吸收分析以及红外光谱分析。结果得出TLH-1、TLH-2和TLH-3的得率分别为0.72±0.04％、0.41±0.10％和0.08±0.01％，从中可以看出，TLH-1的得率最高，而TLH-3的得率最低，说明TLH-3最难提取。在对三种多糖的蛋白和多糖含量测定中可以得出，TLH-1蛋白含量最高，为1.31±0.05％，TLH-3的蛋白含量最低，为0.68±0.01％，三种多糖的蛋白质含量都很低，说明蛋白基本全部除去。在总糖含量的测定中，三种多糖的总糖含量都高于90％，而TLH-3的多糖含量最高，为97.4±1.24％。通过全紫外吸收分析得出，三种多糖含核酸和蛋白质量甚微;在红外光谱分析结果中，三种多糖组分均呈现糖的特殊吸收峰。综上所述，提取方法可行，为后续工作提供了实验材料的保证。
　　其次，通过研究金福菇TLH-1、TLH-2和TLH-3对DPPH自由基和O2-自由基的清除作用以及对人胚肺成纤维细胞的抗氧化能力的影响。结果表明，TLH-1、TLH-2和TLH-3对清除DPPH自由基和O2-自由基都有同样的清除效果。其中TLH-1和TLH-2的清除作用最低，而TLH-3清除效果最好，尤其是在清除DPPH自由基能力与阳性对照Vc大致一样。同样，TLH-1、TLH-2和TLH-3对人胚肺成纤维细胞都存在抗氧化能力，TLH-1和TLH-2的抗氧化作用最低，TLH-3抗氧化能力最高，与上述实验结果一致。在细胞抗肿瘤实验中，TLH-1对Hela和HepG2细胞的抑制率几乎没有，而TLH-2和TLH-3组分对Hela细胞和HepG2细胞的生长有一定的抑制作用，并与剂量和时间有关，但是对正常细胞的作用却不明显，其中TLH-3的抑制效果最好。总之，金福菇多糖TLH-2和TLH-3组分具有潜在的辅助治疗癌症的作用。
　　最后，由于金福菇TLH-3的抗氧化能力最高，所以对其进行降解并研究其活性与构效关系。经分子量测定后得出，金福菇多糖TLH-3的分子量为5.134×103Da。对TLH-3的酸解，进行分子筛分离得到TLH-3A和TLH-3B，收集二者并进行分子量测定和DPPH自由基以及O2-自由基的清除能力检测。结果得出TLH-3A的含量和分子量都高于TLH-3B，分别为3.193×103Da和1.541×103Da。进行的DPPH自由基和O2-自由基的清除能力检测可得出:TLH-3A对DPPH自由基和O2-自由基的清除能力明显高于TLH-3B，但其清除率小于Vc。总之，金福菇TLH-3部分的活性结构都集中于TLH-3A。

目录

声明

摘要

第一章 前言

1．金福菇的研究现状

2．天然多糖的组成、结构与活性

3．本课题研究的主要内容、目的、创新点及意义

第二章 金福菇多糖的分离、纯化及理化性质分析

1．实验材料

1．1 实验材料和试剂

1．2 实验主要仪器

2．实验方法

2．1 金福菇粗多糖的提取分离

2．2 金福菇多糖的处理(Sevag法除蛋白)

2．3 利用层析方法分离纯化金福菇多糖

2．4 利用超滤技术分离纯化金福菇多糖

2．5 总糖含量的测定

2．6 还原糖含量的测定

2．7 蛋白含量测定

2．8 全紫外波长扫描分析

2．9 样品糖红外光谱扫描

2．10 数据分析

3．结果与分析

3．1 金福菇粗多糖的提取分离

3．2 金福菇多糖含量测定

3．3 金福菇还原糖含量测定

3．4 蛋白含量测定

3．5 全紫外波长扫描分析

3．6 样品糖红外光谱扫描

4．本章小结

第三章 金福菇多糖的抗氧化和抗肿瘤活性的研究

1．实验材料

1．1 实验材料和试剂

1．2 实验主要仪器

2．实验方法

2．1 金福菇多糖清除DPPH自由基的测定

2．2 金福菇多糖清除O2-自由基的测定(邻苯三酚自氧化法)

2．3 金福菇多糖对人胚肺成纤维细胞抗氧化能力的影响

2．4 金福菇多糖的抗肿瘤分析

2．5 统计学分析

3．结果与分析

3．1 金福菇多糖清除DPPH自由基的测定

3．2 金福菇多糖清除O2-自由基的测定(邻苯三酚自氧化法)

3．3 金福菇多糖对细胞活力的影响

3．4 金福菇多糖对细胞自由基含量的影响

3．5 金福菇多糖对细胞清除自由基相关酶的影响

3．6 金福菇多糖的抗肿瘤分析

4．本章小结

第四章 金福菇多糖TLH-3理化性质、降解及抗氧化的研究

1．实验材料

1．1 实验材料和试剂

1．2 实验主要仪器

2．实验方法

2．1 金福菇TLH-3及TLH-3片段的分子量测定

2．2 金福菇多糖TLH-3的的盐酸降解

2．3 金福菇多糖TLH-3片段的分离纯化

2．4 金福菇多糖TLH-3片段的抗氧化分析

2．5 统计学分析’

3．结果与分析

3．1 金福菇TLH-3的分子量测定

3．2 金福菇多糖TLH-3片段的分离纯化

3．3 金福菇多糖TLH-3片段的分子量测定

3．4 金福菇多糖TLH-3片段的抗氧化分析

4．本章小结

第五章 结论

参考文献

致谢

攻读硕士学位期间发表的学术论文