淀粉结合结构域AmyP-SBD的结构研究及类泛素蛋白SAMP2的嗜盐机制研究

摘要

淀粉结合结构域(SBD)在α-淀粉酶的功能方面发挥着重要作用。AmyP是从海洋宏基因组文库中筛选出的一个新型α-淀粉酶，是第一个被发现的可以快速降解生淀粉的α-淀粉酶。AmyP属于糖苷水解酶13家族(GH13)，归属于新的GH13-37亚家族，可能是来自于古老细菌中α-淀粉酶的一个独立的分支。对AmyP的C端的序列分析和功能研究显示其C端为一个SBD，同其他SBD序列相比具有较低的相似性，属于新的CBM69家族的成员，AmyP-SBD对可溶性淀粉相比生淀粉有更强的催化活性，表明在可溶性淀粉的水解方面起到重要的作用，扩宽了我们对SBD功能的认识。前期研究表明AmyP-SBD与β-环糊精有较强的相互作用，且在与β-环糊精结合前后经历从无序转化为有序的过程，AmyP-SBD的这种底物诱导折叠在其他SBD中是很罕见的。对AmyP-SBD结构的解析，有助于进一步阐释AmyP独特的生淀粉偏好性及底物诱导折叠现象。
　　本研究利用NMR的方法对AmyP-SBD与β-环糊精结合后的三维结构进行了解析。主链的化学位移认证已经完成，结构的初步计算结果显示其折叠与其它SBD相似，但在拓扑结构等上有显著不同，可能与其特性相关。精细结构的计算仍在进行。揭示嗜盐蛋白的嗜盐机制有利于阐释生物多样性形成的机制及极端环境适应机制，在理论和实践上具有重要的意义。在这方面目前主要有几种观点，分别与蛋白质表面电荷的多少、疏水残基的数目以及侧链的长度相关联。但是，这些机制是否适用所有嗜盐蛋白？有没有其它机制？这些问题都有待研究。SAMP2蛋白是从嗜盐古菌Haloferax volcanii中确认的一个类似ubiquitin的蛋白，其在高盐环境下的溶液和晶体结构已经被解析，结果显示它们的结构与真核生物Ubl保守的β-grasp结构类似。值得注意的是，在低盐条件下，SAMP2蛋白有两套构象，一套是有序的构象，与高盐条件下结构相同，而另一套则与细菌Ubiquitin-like蛋白Pup类似，是无序的，两套构象的平衡随盐浓度的升高逐渐向有序构象转移。在本论文工作中，我们通过定点突变和定向进化的方法对各位点及其突变类型对SAMP2的结构及其盐依赖性的影响进行探究，以验证以上机制的正确性并揭示潜在的其它适盐机制，同时为类泛素蛋白结构和功能进化进程的阐明提供线索。结果显示，按照已知机制增加侧链长度和疏水性的并不能使SAMP2更适应低盐环境，而使蛋白在低盐环境更好折叠的突变与已有机制不符。其中的奥妙，需要进一步深入研究。

目录

声明

摘要

符号说明

第一部分 海洋细菌α-淀粉酶淀粉结合结构域AmyP-SBD的结构研究

第一章 引言

1．1 碳水化合物结合结构域(CBMs)

1．2 淀粉结合结构域(SBD)

1．3 AmyP-SBD

1．4 课题目的及意义

第二章 材料与方法

2．1 实验材料

2．2 实验方法

第三章 结果和讨论

3．1 AmyP-SBD的表达和纯化

3．2 AmyP-SBD的透析和浓缩

3．3 AmyP-SBD最终紧凑构象的形成

3．4 AmyP-SBD的二维核磁共振检测

3．5 AmyP-SBD的结构解析

3．6 讨论

结论与展望

第二部分 古细菌Ubiquitin-like蛋白SAMP2适盐的机制研究

第四章 研究背景介绍

4．1 古细菌

4．2 SAMP2蛋白

4．3 嗜盐蛋白及其特性

4．4 嗜盐蛋白的耐盐机制研究进展

4．5 课题目的和意义

第五章 材料与方法

5．1 实验材料

5．2 实验方法

第六章 结果与讨论

6．1 定点突变的方法构建SAMP2突变体

6．2 定向进化的方法构建SAMP2突变体

6．3 WT-SAMP2及突变体蛋白的表达和纯化

6．4 WT-SAMP2及SAMP2突变体在不同NaCl条件下的性质测定

6．5．讨论

结论和展望

参考文献

补充材料

附录

致谢