常染色体显性多囊肾疾病行胚胎植入前遗传学诊断的方法研究

摘要

目的： 常染色体显性多囊肾疾病(autosomal dominant polycystic kidney disease，ADPKD)是人类最常见的单基因遗传病之一，人群中的发病率为1/1000，是发病率最高的遗传性肾病，居我国终末期肾衰竭病因的第4位。 引起ADPKD的突变基因有PKD1和PKD2，现认为可能存在PKD3。PKD1是最常见的致病基因，定位于染色体16p13.3，基因长度为47kb，含有46个外显子。PKD2基因定位于染色体4q21-23，基因长度为70 kb，含有15个外显子。PKD1和PKD2的蛋白产物为多囊蛋白，其异常是导致多个脏器特别是肾脏进展性等多囊性改变的主要原因。ADPKD的主要表现为双侧肾脏形成多个液性囊泡，囊肿进行性增大，造成肾脏结构和功能的损害，最终引起终末期肾病(end-stage renal disease，ESRD)。除了肾脏病变外，还累及全身多个器官，如肝囊肿、高血压、颅内动脉瘤、心瓣膜畸形等，因此ADPKD是一种全身性疾病。目前对ADPKD的治疗尚无特异的治疗措施，只是一些对症治疗和延缓多囊肾病向ESRD进展的干预措施，多数患者最终将发展到终末期肾衰而不得不进行肾脏替代治疗和肾移植手术。 由于ADPKD延迟性发病的特点，平均发病年龄在40岁左右，其突变基因携带者在婚育年龄可能尚未发病，因此ADPKD携带者常低估ADPKD的遗传风险。由于ADPKD呈常染色体显性遗传，事实上50％的后代有ADPKD的遗传风险。近年来，胚胎植入前遗传学诊断(preimplantation genetic diagnosis，PGD)已被成功应用于ADPKD。PGD做为一种比传统产前诊断更早的诊断方法，对配子或着床前的胚胎进行遗传物质分析，选择没有异常遗传物质的胚胎进行移植，既能防止患儿的产生，又能避免治疗性流产和引产给夫妇双方带来生理和心理上的创伤。 由于PKD1和PKD2基因庞大，结构复杂，有较多的重复序列，突变的种类多，可能涉及整个基因，没有突变热点，因此进行直接突变检测较为困难。本研究主要利用与PKD1紧密连锁的KG8、SM6、CW4、CW2和与PKD2连锁的D4S1534、D4S1563、D4S414、D4S423等8个微卫星作为遗传标记，先对多囊肾家系进行遗传学分析，找出与致病基因连锁的微卫星，而后用该微卫星对废弃胚胎的微卫星分型结果进行分析，以建立PKD1所致的ADPKD的胚胎植入前遗传学诊断方法。 方法： 1、获取3个多囊肾家系成员的外周血，提取DNA，利用聚合酶链反应和毛细管电泳对多囊肾家系成员进行STR(short tandem repeats，STR)分型，包括与PKD1紧密连锁的KG8、SM6、CW4、CW2和与PKD2连锁的D4S1534、D4S1563、D4S414、D4S423的8个微卫星，通过基因连锁分析，找出与致病基因连锁的微卫星。对其中1个家系在行常规体外受精胚胎移植后的不适宜移植和冷冻的废弃胚胎5个共15个卵裂球进行了STR分型。 2、对2个志愿者提供的共64个淋巴细胞利用四重巢式PCR和毛细管电泳对KG8、SM6、CW4和CW2四个位点进行STR分型。 结果： 1、建立家系系谱图，遵照孟德尔遗传规律进行基因连锁分析发现，3个家系发病均由PKD1突变所致。 2、在家系的分析中，A-Ⅱ-1、A-Ⅱ-3、A-Ⅱ-4、A-Ⅱ-6、A-Ⅲ-1、B-Ⅱ-3、C-Ⅱ-1、C-Ⅱ-3和C-Ⅲ-1共9个SM6的STR分型结果和卵裂球的SM6的STR分型结果均不能由亲代推导出，A-Ⅱ-3的D4S1563同样也发生了类似的现象，其余6个微卫星位点均出现此类情况。考虑到SM6测序结果的不稳定性，其可能不适合作为ADPKD的连锁标记。 3、5个废弃胚胎的15个卵裂球9个行四重巢式PCR，7个扩增成功，6个行双重巢式PCR，均扩增成功，扩增成功率为86.67％(13/15)，未发现污染，SM6结果不能由亲代推导出，有3个卵裂球的KG8位点出现ADO，而CW4与CW2未出现ADO。两个胚胎携带致病基因。 4、单个淋巴细胞扩增成功率为85.93％(55/64)，SM6扩增成功率为89.06％(57/64)，CW4扩增成功率为92.18％(59/64)，CW2扩增成功率为89.06％(57/64)，KG8位点的ADO率为25.64％(10/39)，CW4位点的ADO率为25％(4/16)，CW2位点的ADO率为7.01％(4/57)，均未发现污染。 5、单个卵裂球和单个淋巴细胞的CW2的STR结果均有酶链滑脱现象。 结论： 1、通过本研究，微卫星KG8、CW4、CW2、D4S1534、D4S1563、D4S414和D4S423可作为遗传标记对多囊肾家系进行基因连锁分析，本研究中单细胞四重巢式PCR扩增成功率高，污染率低，等位基因脱扣率低，该方法为与PKD1连锁的常染色体显性多囊肾疾病的胚胎植入前遗传学诊断提供了可靠的依据。 2、SM6基因的STR测序结果的不稳定性和微卫星CW2的酶链滑脱现象有待进一步研究。 3、通过该实验研究，我们可以考虑为另两个家系做胚胎植入前遗传学诊断，达到优生优育的结果。

目录

文摘

英文文摘

声明

前言

材料和方法

结果

分析与讨论

结论

参考文献

附录

致谢

植入前遗传学诊断技术在单基因遗传性疾病中的应用现状及展望