肺炎克雷伯菌质粒基因组的高通量测序和遗传变异分析

摘要

研究目的： 1.分离、鉴定和纯化临床来源的多重耐药肺炎克雷伯菌206株(2002年-2008年间)，确定其耐药谱和质粒谱； 2.获得1株代表性多重耐药肺炎克雷伯菌的质粒全序列，并结合生物信息学工具确定质粒全序列编码的基因，并预测各编码基因的功能； 3.Solexa高通量测序所有206株多重耐药肺炎克雷伯菌的全部质粒基因组DNA，获得大规模短序列； 4.将Solexa高通量测序获得的短序列和代表性多重耐药肺炎克雷伯菌的质粒全序列进行比对定位，揭示多重耐药肺炎克雷伯菌质粒DNA的遗传变异和分子进化机制。 方法： 1、收集临床来源的多重耐药肺炎克雷伯菌，测定耐药谱和耐药程度(MIC)，碱裂解法提取肺炎克雷伯菌质粒DNA； 2、构建插入大小为2-3Kb的pUC18文库和35-40Kb的Fosmid文库，采用传统Sanger法测序，利用Phred/Phrap/Consed软件进行序列拼接，根据pUC18和Fosmid文库克隆末端关系及PCR反应，完成contig之间的连接； 3、提取所有206株多重耐药肺炎克雷伯菌的全部质粒DNA，Solexa高通量测序获得大规模的短序列。根据菌株来源的年代，将所有高通量测序的多重耐药肺炎克雷伯菌质粒基因组分为两个不同的部分；第一部分包含110株菌株(S1)，采集时间为2002-2006，第二部分包含96株菌株(S2)，采集时间是2007-2008； 4、采用Solexa Genome Analysis System和MAQ软件包，将高通量测序获得的短序列比对定位到参照质粒全序列上； 5、采用比较基因基因组学和分子进化方法分析揭示多重耐药肺炎克雷伯菌质粒DNA的遗传变异和分子进化机制。 结果： 1.第一批数据中包含110株多重耐药肺炎克雷伯菌(S1)的Solexa reads总数为8，862，022，其中可以定位到3个参照质粒基因组上的序列约占30％。第二批数据包含96株多重耐药肺炎克雷伯菌(S2)的solexa reads总数为8，141，863，其中29％的reads可以定位到参照质粒基因组上； 2.对两批数据的定位结果分析得知，两批样品中pKF3-94质粒的覆盖度都约为500倍，而对于其余两个质粒pKF3-70和pKF3-140则差异较大，在第二批样品中存在明显的质粒丢失。 3.分析两批不同数据中相同SNPs的分布频率，结果发现pKF3-94在两批不同数据中，SNPs分布频率基本相同，而pKF3-70和pKF3-140则相差非常大。 4.分析找到的SNPs，发现这些SNPs中的一大部分都位于编码区(83.4％in S1，83.5％in S2)，其中一大部分又是非同义替换(27.1％of total SNPs in S1和24.7％of total SNPs in S2) 5.有意思的是，发现这些非同义替换的SNPs主要位于耐药基因、质粒接合转移相关基因、质粒复制和分化相关基因。 6.在测序获得的Solexa短序列中，意外地发现存在很多的共进化的非同义替换SNPs位点，并且这些主要都位于质粒接合转移相关基因。 结论： 1.在方法学上，首次表明新一代高通量测序技术非常适合用来分析多重耐药细菌的质粒基因组的遗传变异规律。同时，对于大小为100K左右的质粒基因组，一个lane的Solexa短序列数据已经足够可以检测不同质粒基因组的SNPs位点 2.除了检测SNPs位点以外，揭示了肺炎克雷伯菌质粒基因组的一个动态过程，表明不同的肺炎克雷伯菌质粒基因组存在大量的基因复制，基因丢失和水平基因转移情况。 3.发现外排泵相关基因(e.g.tetracycline efflux pump，ABC transporter)、耐药相关基因(e.g.beta-lactamase，macrolide phosphotransferase，streptomycin adenylyltransferase， aminoglycoside acetyltransferase， aminoglycoside phosphotransferase)在2部分不同的肺炎克雷伯菌质粒基因组Solexa短序列中存在显著差异，而造成这一结果的原因可能是第二部分肺炎克雷伯菌耐药程度的增加。 4.系统分析了206株肺炎克雷伯菌质粒基因组的SNPs位点，发现质粒接合转移相关基因和耐药基因(e.g.beta lactamase，tetracycline efflux protein，and aminoglycoside resistance enzymes)可能受到了正选择压力，从而存在着大量的非同义替换SNPs位点。 5.发现了很多共进化的非同义替换SNPs位点，导致这些共进化的非同义替换SNPs位点发生的主要原因应该是受到了很强的选择压力。有意思的是这些共进化的非同义替换SNPs位点主要位于质粒接合转移的相关基因上。目前确定的这些共进化的非同义替换SNPs位点可以做为今后深入研究的靶位点。

目录

文摘

英文文摘

声明

1、前言

2、材料方法

3 结果

4、讨论

结论

参考文献

附录 已发表论文

致谢

综述：新一代高通量测序技术对微生物研究的影响