6株高毒力肺炎克雷伯菌全基因组测序及比较基因组学分析

摘要

目的：近三十年高毒力肺炎克雷伯菌（ Hypervirulent Klebsiella pneumoniae，hvKP）在亚洲太平洋地区和西方国家被越来越多地报道。hvKP能引起严重的迁移性感染如肝脓肿，眼内炎，脑膜炎等。目前基于基因组背景的 hvKP研究较少，限制了我们从全基因组水平了解hvKP，因此我们对6株高毒力血清型肺炎克雷伯菌进行全基因组测序及比较基因组学分析，增加对hvKP基因组水平的了解，为近一步探讨其致病机制奠定基础。 方法：首先PCR筛选出6株高毒力血清型菌株，用拉丝试验（string test，ST）测定6株高毒力血清型肺炎克雷伯菌的超黏性。其次，提取细菌全基因组DNA后通过Illumina Hise4000测序平台对6株hvKP进行全基因组测序，测序下机的数据经过处理后使用 SOAPdenovo短序列组装软件进行组装，采用 Glimmer软件进行组装结果的基因预测，将预测的基因翻译成氨基酸，在 KEGG和 COG库进行比对和基因功能注释。基于测序样品基因组序列、基因集序列和参考序列NTUH-K2044基因组进行比较基因组学分析，从而展现测序样品与参考序列的差异及进化关系，包括结构变异（共线性）、基因家族聚类分析、特有基因、SNP和InDel检测、进化分析。最后用VFDB数据库预测基因组中的毒力基因，同时结合文献报道分析筛选出肺炎克雷伯菌的毒力基因，并在 NCBI核酸库下载所选毒力基因的参考序列，将下载的参考序列分别与6株hvKP的全基因组序列进行BLAST比对分析以确定毒力基因在6株hvKP中的分布情况。同时对检测到的毒力基因做基于SNP的变异分析，进而推测影响细菌致病力的毒力相关基因。 结果：拉丝试验结果显示6株hvKP均为超黏性菌株。基因组测序组装结果显示6株hvKP的基因大小在5.34Mb到5.58 Mb之间，GC含量57.22%-57.46%。比较基因组分析显示7株hvKP的基因组之间的共线性较好，基因组之间存在插入、缺失现象，基因组存在较多的易位、倒位等基因组重排事件。通过与参考株NTUH-K2044序列进行比对，我们发现6株hvKP存在非常丰富的SNP和InDel多态性。基于SNP的进化树结果表明6株hvKP与NTUH-K2044分别处于两个进化分支上，进化距离较远，5株非K1血清型的hvKP有更近的进化距离。BLAST比对分析发现一些毒力基因例如kfu, allS, iucABCDiutA等在5株非K1型hvKP全基因组序列中的分布不同。同时基于SNP的毒力基因变异分析也显示一些毒力基因例如mrkD，ureDABCEFG等基因发生不同程度的SNP突变。 结论：本研究通过对6株 hvKP进行全基因组测序分析以及和NTUH-K2044基因组的比较分析，对hvKP的基因组组成，基因多态性，进化情况及毒力基因情况有了基本的了解。这6株hvKP的基因组背景为我们进一步对hvKP进行基因研究和致病机制的深入研究奠定基础。

目录

声明

英汉缩略语名词对照

前言

1 材料

1.1菌株

1.2主要试剂

1.3主要培养基

1.4主要仪器

2方法

2.1菌株的复苏活化

2.2拉丝试验（超黏性实验）

2.3细菌全基因组 DNA提取

2.4基因组序列的测定

2.5比较基因组学分析

2.6 hvKP毒力相关基因比较分析

3结果

3.1拉丝试验（超黏性实验）

3.2基因组DNA的提取

3.3 6株hvKP全基因组测序结果

3.4基因组预测基因的功能注释

3.5高毒力肺炎克雷伯菌比较基因组学分析

3.6 7株hvKP的进化分析

3.7毒力相关基因分析

4讨论

结论与展望

参考文献

文献综述:高毒力肺炎克雷伯菌的研究进展

致谢

攻读学位期间发表学术论文

附表