GPR48通过HB-EGF反式激活EGFR诱导上皮细胞增殖和迁移的分子机制研究

摘要

目的:本课题组在之前的研究中已经证明GPR48通过EGFR信号通路来调节眼睑上皮细胞的增殖和迁移,进而调控小鼠的眼睑发育,但其具体分子机制尚不清楚。本实验将在之前研究的基础上,对GPR48通过EGFR通路调控上皮细胞增殖和迁移的分子机制进行深入研究,进一步探讨GPR48调控眼睑发育的分子机制。
　　 方法:①在体外培养的Gpr48+/+和Gpr48-/-小鼠原代上皮细胞中加入EGFR的特异性酪氨酸激酶抑制剂AG1478后,用Western blot检测EGFR的磷酸化程度及其下游信号通路分子的活化情况；
　　 ②使用免疫共沉淀法富集Gpr48+/+和Gpr48-/-小鼠原代上皮细胞条件培养基中EGFR的配体分子,Western blot检测这些配体的蛋白表达情况；
　　 ③采用免疫沉淀的方法分别剔除Gpr48+/+与Gpr48-/-小鼠原代上皮细胞条件培养基中EGFR配体,并用该培养基培养Gpr48-/-细胞,应用Western blot检测EGFR及其下游信号分子的磷酸化水平；
　　 ④加入外源性HB-EGF或其抑制剂CRM197作用细胞,应用Western blot检测EGFR的磷酸化及其下游信号通路分子的活化状态；
　　 ⑤同时用体外BrdU和体外细胞划痕两种功能实验检测上皮细胞的增殖与迁移能力以验证以上实验结果。
　　 结果:(1)加入AG1478抑制剂作用Gpr48+/+与Gpr48-/-原代上皮细胞20min后,发现Gpr48+/+小鼠原代上皮细胞中P-EGFR水平明显下降。与此同时,细胞功能实验中,检测发现经AG1478处理后,Gpr48+/+原代上皮细胞的增殖和迁移能力也受到了明显的抑制；
　　 (2)Western blot检测显示ERK、STAT3磷酸化水平在Gpr48-/-原代上皮细胞中明显低于Gpr48+/+原代上皮细胞,当加入AG1478作用后,Gpr48+/+与Gpr48+/+细胞的ERK、STAT3磷酸化水平都被抑制,Gpr48+/+原代上皮细胞的抑制程度更强；
　　 (3)Western blot检测Gpr48+/+和Gpr48-/-原代上皮细胞条件培养基中EGFR配体的蛋白表达,发现HB-EGF在Gpr48-/-小鼠原代上皮细胞培养基中的量明显低于在Gpr48+/+小鼠原代上皮细胞中的量,而EGF、TGF-α二者的蛋白表达没有差别；
　　 (4)免疫沉淀法分别剔除野生型和基因敲出型条件培养基中的EGF、TGF-α后刺激Gpr48-/-上皮细胞10min,野生型上皮细胞的条件培养基可以激活Gpr48-/-上皮细胞中EGFR及其下游信号分子的活化；而剔除了Gpr48+/+原代上皮细胞条件培养基中的HB-EGF后,则不能激活Gpr48-/-上皮细胞中的EGFR及其下游信号分子的活化；
　　 (5)加入外源性HB-EGF刺激Gpr48-/-原代上皮细胞后,发现Gpr48-/-中P-EGFR、P-ERK、P-STAT3水平明显升高；而用CRM197处理Gpr48+/+原代上皮细胞后,P-EGFR、P-ERK、P-STAT3水平明显下调；
　　 (6)细胞功能实验研究发现,HB-EGF作用Gpr48-/-原代上皮细胞前,Gpr48-/-细胞的增殖和迁移能力低于Gpr48+/+原代上皮细胞；用HB-EGF作用Gpr48-/-原代上皮细胞后,其增殖能力明显增加,但迁移能力未得到明显提高。
　　 结论:在眼睑的发育中,GPR48通过HB-EGF反式激活EGFR信号通路,从而活化下游的ERK、STAT3等信号分子,进而促进上皮细胞的增殖和迁移。