苯介导的部分毒性相关基因表达变化及甲基化状态分析

摘要

苯被广泛应用于工业生产和日常生活，暴露几乎难于避免，但苯具有较强的造血系统的细胞毒性和遗传毒性，危害不容忽视。 以往苯的毒性机制研究多聚焦在代谢产物的遗传毒性、自由基氧化损伤及相关基因多态性等方面，近年来表观遗传学(cpigcnetics)的兴起，为苯的毒性机制研究提供了新的视角和思路。本研究采用苯醌处理原代培养的骨髓细胞和小鼠亚慢性苯吸入毒性实验，对部分苯毒性相关基因的表达和甲基化状态进行了实验研究，以探讨苯毒性的表观遗传学机制。 1.苯醌(1，4-benzoquinone，BQ)对骨髓细胞中印记基因Igf2和H19表达及Igf2/H19印记调控区域(Igf2/H19 imprinting control region，Igf2/H19 ICR)CpG岛的甲基化状态的影响： 方法： 分别用0、0.1、1、10μ mol/L4个浓度的BQ对原代培养的小鼠骨髓细胞进行24h染毒，运用实时荧光定量PCR(Real-time PCR)检测印记基因Igf2和H19的mRNA表达；应用重亚硫酸盐测序法(Bisulfite sequencing，BSP)检测Igf2/H19 ICR CpG岛的甲基化状态。 结果： (1)与对照组相比，0.1μ mol/L BQ处理，Igt2和H19 mRNA表达没有发生明显改变，但1、10μ mol/L的BQ处理，两印记基因的表达均显著升高。其中，1μ mol/L的BQ处理，Igf2和H19 mRNA表达分别增高了0.34倍(P<0.05)和0.71倍(P<0.05)；10μ mol/L BQ处理，分别增高了2.53倍(P<0.01)和1.88倍(P<0.01)； (2)染毒前后Igf2/H19 ICR CpG岛的甲基化状态未发生改变。 结论：BQ处理导致印记基因Igf2和H19的mRNA表达上调，但对Igf2/H19ICR CpG岛的甲基化状态未产生影响。提示Igf2和H19的mRNA表达可能还受到Igf2/H19 ICR以外的其他调控机制调节。 2.BQ对苯毒性相关基因Bcl-2、Bax、P21、Wig1和Gadd45α的mRNA表达的影响： 方法： 0、0.1、1、10μ mol/L的BQ处理原代培养的小鼠骨髓细胞24h，Real-timePCR检测Bcl-2、Bax、P21、Wig1和Gadd45α等基因mRNA表达。 结果： BQ处理后，Bcl-2、Bax、P21、Wig1和Gadd45α等苯毒性相关基因mRNA表达没有显著改变。 结论： 在体外，未见BQ对小鼠原代培养的骨髓细胞Bcl-2、Bax、P21、Wig1和Gadd45α等基因表达的影响。 3.亚慢性苯吸入染毒对小鼠血液参数、脏器指数及相关代谢酶基因表达及甲基化状态的影响： 方法： 分别采用0ppm、1ppm和100ppm的苯对C57BL/6J小鼠进行每天8个小时，每周5天，共计13周的亚慢性动式吸入染毒。染毒结束后，进行外周血血液学各项参数和主要脏器系数检查；Real-time PCR检测代谢酶相关基因Cyp2el、Gstml和Gsttl的mRNA表达；BSP检测启动子区CpG岛CpG位点的甲基化状态。 结果： (1)与对照组(0ppm)相比，100ppm染毒组小鼠红细胞数(RBC)、白细胞数(WBC)、血红蛋白(Hb)和血小板计数(PLT)均显著下降，且差异有统计学意义(P<0.01)；平均红细胞血红蛋白含量(MCH)和平均红细胞体积(MCV)显著升高，且差异有统计学意义(P<0.01)；1ppm染毒组小鼠红细胞数(RBC)、白细胞数(WBC)和血红蛋白(Hb)均下降，且差别有统计学意义(P值分别为<0.01，<0.05，<0.05)，平均红细胞血红蛋白含量(MCH)和平均红细胞体积(MCV)显著升高，且差异有统计学意义(P<0.01)。 (2)与对照组相比，100ppm染毒组肝脏指数有显著升高(P<0.05)，1ppm染毒组未见明显改变；100ppm和1ppm睾丸指数均有显著下降(P<0.05)；100ppm染毒组附睾指数显著升高(P<0.05)，1ppm染毒组未见明显改变。 (3)与对照组相比，100ppm组Cyp2el、Gstml和Gsttl基因mRNA表达分别下降至67.78％，51.1％和5.O％，差异均具有统计学意义(P值分别为P<0.05，P<0.01，P<0.01)：1ppm组Gsttl基因mRNA表达下降至28.92％(P<0.01)，而Cyp2el和Gstml基因mRNA表达改变未见统计学意义(P>0.05)。 (4)Cyp2el启动子区有1个CpG岛，共7个CpG位点。对照组(0ppm)呈非甲基化状态，染毒组(1 ppm和100 ppm)均呈部分甲基化状态。而Gstml基因启动子区CpG岛上的10个CpG位点以及Gsttl基因启动子区CpG岛上的14个CpG位点全部呈非甲基化状态。 结论： (1)血液学参数检测测定结果表明：在染毒剂量范围内，苯对血液系统产生了一定程度的损伤效应。 (2)苯对代谢酶基因Cyp2el、Gstml和Gsttl的表达产生影响，且改变了Cyp2el的甲基化状态，但不改变Gstml和Gsttl基因启动子CpG岛的甲基化状态。提示Cyp2el表达的改变可能与其甲基化状态的改变相关。 综合本研究结果，在一定的染毒剂量范围内，苯对印记基因Igf2和H19以及代谢酶相关基因Cyp2el、Gstml和Gsttl表达产生了影响，改变了Cyp2el的甲基化状态。