miR-301a在胃癌中的表达及意义和诱导胃癌细胞克隆形成、侵袭和迁移的机制

摘要

研究背景:在全球，胃癌的死亡率仅次于肺癌居第二位，在我国也是死亡率最高的恶性肿瘤之一，其5年生存率低于40％，早期诊断和治疗是提高生存率的重要手段，因此寻找理想的早期诊断标记物和治疗靶点，对改善患者生存率有重要意义。MicroRNA是一类内源性非编码的功能性RNAs，大约21-25个核苷酸，它通过调节mRNA的翻译或降解而起到致癌或抗癌作用。其在肿瘤中的异常表达体现了其与人类肿瘤的形成、发生、发展的密切相关，针对miRNA与肿瘤的研究充分体现了miRNA参与基因调控的复杂性，它们调控的靶基因关系着肿瘤细胞的分化、增殖、克隆、侵袭等，因此以miRNA为切入点，研究胃癌形成、发展、浸润和转移过程中的作用及机制，为胃癌早期诊断、预后评估和靶向药物治疗等开辟了新的途径。
　　 目的:检测miR-301a在人胃癌细胞系(AGS、MKN-28、BGC-823、HCG-27、SGC-7901和MKN-45)、人正常胃上皮细胞GES-1表达，在人胃癌组织的表达及其临床病理意义;探讨miR-301a对人胃癌细胞SGC-7901、HCG-27细胞克隆、侵袭和迁移的影响以及对靶基因NF-kB蛋白表达的调控。
　　 方法:提取人胃癌细胞系(AGS、MKN-28、BGC-823、HCG-27、SGC-7901和MKN-45)、人正常胃上皮细胞GES-1及29例人胃癌组织及其配对的癌旁非肿瘤胃粘膜组织的miRNAs，按miScript Reverse Transcription Kit合成cDNA，miR-301a、靶基因NF-kB和U6引物购自QIAGEN公司，用ABI7500 FAST型荧光定量PCR仪进行实时荧光定量PCR。将5.0×105个细胞/孔接种于6孔培养板中，37℃、混匀，5％CO2孵育箱静置培养24小时。按Lipofectamine2000说明书将NegativeControl B和miR-301a抑制物各2μl(50pmol/μl)转入SGC-7901和HCG-27细胞，转染24小时后荧光显微镜检测转染效率、RT-PCR检测miR-301a和靶基因NF-kB的表达水平，并观察细胞克隆、侵袭和迁移能力。转染72小时后WesternBlot法检测靶基因NF-kB的表达水平。应用原位杂交技术检测miR-301a在304例石蜡固定人胃癌组织芯片标本的表达水平。
　　 结果:miR-301a和靶基因在人胃癌细胞株AGS、MKN-28、BGC-823、HCG-27、SGC-7901和MKN-45的表达量显著高于人正常胃上皮细胞GES-1的表达量，miR-301a在76.67％(23/30)的胃癌组织高表达。人胃癌细胞株SGC-7901和HCG-27转染miR-301a抑制物24小时后miR-301a的表达显著降低。转染miR-301a抑制物48小时后，转染miR-301a抑制物组SGC-7901和HCG-27细胞克隆数显著低于Negative Control B组，差异具有显著意义。转染miR-301a抑制物组SGC-7901和HCG-27细胞迁移细胞数显著少于Negative Control B组和Normal Control组，差异具有显著性;而Negative Control B组和NormalControl组比较差异无显著性。人胃癌细胞株SGC-7901和HCG-27转染miR-301a抑制物和Negative Control B后48小时做侵袭实验，转染miR-301a抑制物组SGC-7901和HCG-27细胞侵袭能力明显低于Negative Control B组。人胃癌细胞SGC-7901和HCG-27转染miR-301a抑制物72小时后，可提高细胞靶基因蛋白的表达水平。原位杂交结果表明miR-301a在癌旁非肿瘤胃黏膜组织中阴性表达，而在60.86％(185/304)的胃癌组织中高表达，miR-301a的表达强度与肿瘤大小、浸润深度、淋巴结转移、淋巴管侵犯及TNM分期有关。miR-301a低表达胃癌患者5年生存率显著高于高表达胃癌患者。
　　 结论:
　　 1.miR-301a及靶基因在人胃癌细胞株AGS、MKN-28、BGC-823、HCG-27、SGC-7901和MKN-45高表达，其表达量显著高于人正常胃上皮细胞GES-1的表达量，miR-301a在76.67％(23/30)的胃癌组织中呈现高表达。
　　 2.miR-301a抑制剂能显著抑制人胃癌细胞株SGC-7901和HCG-27细胞的克隆形成、迁移和侵袭能力，并能下调SGC-7901和HCG-27细胞靶基因NF-kB蛋白的表达。
　　 3.miR-301a在人胃癌组织中的异常表达与肿瘤大小、浸润深度、淋巴结转移、淋巴管侵犯及TNM分期有关。miR-301a低表达胃癌患者5年生存率显著高于高表达者。
　　 4.miR-301a可以作为胃癌早期诊断和判断预后的分子标记物，为进一步应用miR-301a抑制剂治疗胃癌的研究奠定了实验依据和理论基础。

目录

摘要

前言

第一部分 miR-301a在胃癌细胞及组织中的表达及其临床病理意义

一、材料与方法

二、结果

第二部分 miR-301a体外对胃癌细胞克隆、侵袭和迁移能力影响研究

一、材料与方法

二、结果

第三部分 靶基因NF-kB在人胃癌细胞中的表达及miR-301a对靶基因NF-kB蛋白表达的调控

一、材料与方法

二、结果

分析与讨论

小结

参考文献

致谢

胃癌与miRNAs

声明