蚕丝-胶原支架联合转染TGF-β3基因的BMSCs用于兔ACL重建的研究

摘要

背景：
　　前交叉韧带(anterior cruciate ligament，ACL)是维持膝关节稳定的重要结构，ACL损伤是运动医学科常见的膝关节损伤性疾病，如不及时治疗，容易引起膝关节的半月板、韧带、关节软骨等的继发性损伤，膝关节不稳定导致软骨磨损加快，甚至导致骨性关节炎的发生。目前，对于ACL撕裂的治疗主要是通过重建手术恢复膝关节的稳定，而用于ACL重建的移植物主要有自体肌腱、同种异体肌腱和人工合成移植材料，但这些材料都存在一定的缺陷。比如自体肌腱移植会加重患者损伤、手术时间延长，术后造成取材肌腱的功能丧失、康复时间延长等;异体肌腱移植主要面临着宿主抗移植物免疫反应、可能会使受体有感染传染性疾病的风险，另外其来源困难也是一个需要考虑的问题;人工合成移植材料短期内疗效较好，但远期效果仍面临着韧带松弛、力学强度下降、宿主免疫反应引起滑膜炎等问题。理想的ACL替代材料应该既能在关节腔内进行韧带再生，同时植入骨隧道的两端又能与骨形成良好的腱-骨界面。近年来随着组织工程的不断发展，为制作理想ACL替代材料创造了可能。胶原是肌腱组织的重要组分，因其良好的生物相容性、能为于细胞提供良好的支持而最先被研究，但提取胶原的力学性能太差，难以提供有效的力学支持;脱胶蚕丝具有良好的力学性能和生物相容性，但其光滑的表面难以为细胞粘附提供条件。将蚕丝和胶原两种生物材料进行交联，既能获得足够的力学强度，又能为干细胞粘附提供支持。骨髓间充质干细胞(bonemarrow mesenchymal stem cells，BMSCs)因取材方便、体外扩增快、具有多向诱导分化能力而被广泛应用于组织工程中，是理想的种子细胞。转化生长因子-β3(transforming growth factor-β3，TGF-β3)是一种具有多种调节功能的生长因子，既能调控软骨和骨的再生过程，又能调控细胞外基质的分泌、减少组织再生过程中的瘢痕形成，因此是一种理想的调控组织工程ACL的细胞生长因子。局部单纯应用生长因子往往会因其在体内的半衰期短而需要多次反复应用或单次大剂量应用才能达到有效浓度，而将生长因子基因转入到种子细胞，使生长因子在作用部位持续表达则解决了这一问题。基于以上研究进展，本课题主要从几个方面进行了研究:(1)兔BMSCs的分离、培养及鉴定;TGFβ3-Lentivirus慢病毒的构建;过表达TGF-β3的BMSCs细胞系的构建及鉴定;(2)蚕丝-胶原支架的制备及其生物学性能检测;(3)蚕丝-胶原支架联合转染TGF-β3基因的BMSCs用于兔ACL重建的实验研究;(4)对蚕丝-胶原支架进行改进，将羟基磷灰石(hydroxyapatite，HA)负载于蚕丝-胶原支架两端，用于兔ACL重建的实验研究。
　　第一部分 兔BMSCs的分离、培养及鉴定;TGFβ3-Lentivirus慢病毒的构建;过表达TGF-β3的BMSCs细胞系的构建及鉴定
　　目的：分离、培养兔BMSCs，通过流式细胞学技术和三系分化能力鉴定其干细胞特性;构建携带TGF-β3基因的慢病毒载体，对BMSCs进行转染，建立稳定表达TGF-β3的BMSCs细胞系。
　　方法：我们通过骨髓腔冲洗、贴壁细胞培养的方法获取兔BMSCs，通过细胞形态、流式细胞学和三系诱导分化对分离培养的BMSCs进行鉴定。构建携带TGF-β3基因，通过感染293T细胞进行病毒颗粒收集，经过病毒滴度、最佳MOI测定后用TGFβ3-Lenivirus感染BMSCs，用RT-PCR和Western Blot技术检测TGF-β3基因在BMSCs中的表达，构建稳定表达TGF-β3的BMSCs细胞系。
　　结果：流式细胞学和三系分化检测，我们培养的骨髓腔冲洗液贴壁培养细胞为BMSCs;通过构建的质粒转染293T细胞得到了病毒滴度为4.85×108TU/ml的病毒液，而病毒在MOI为200时对兔BMSCs的转染效率可达100％;通过RT-PCR和Western Blot技术检测发现TGF-β3在稳转的BMSCs细胞系中过表达。
　　结论：通过骨髓冲洗液贴壁培养获取的兔BMSCs具有干细胞特征和多向分化能力;构建的TGFβ3基因慢病毒载体在转染BMSCs后能稳定表达，建立了稳转细胞系。
　　第二部分 蚕丝-胶原支架的制备及其生物学性能检测
　　目的：制备蚕丝-胶原文架并对其生物学性能进行分析。
　　方法：通过乙酸抽提的方法从猪跟腱中获取Ⅰ型胶原，用Na2CO3溶液水浴法对生蚕丝网片进行脱胶，将胶原溶液和脱胶蚕丝网片通过冷冻干燥和真空热交联法进行交联，制作蚕丝-胶原支架材料。用Instron万能拉力机对生蚕丝网片、脱胶蚕丝以及蚕丝-胶原支架进行生物力学测定。将BMSCs与蚕丝-胶原支架进行共培养，用扫描电子显微镜(SEM)观察支架表面细胞的形态。
　　结果：蚕丝网片在脱胶前后及整合胶原后，其力学性能（最大拉力和刚度）无明显变化;BMSCs与蚕丝-胶原支架进行共培养后仍保持着梭形，细胞状态良好。
　　结论：脱胶、整合胶原等过程未对蚕丝力学性能造成影响，整合胶原后支架表面形成了多孔、粗糙的表面，更有利于细胞的粘附和生长。
　　第三部分 蚕丝-胶原支架联合转染TGF-β3基因的BMSCs用于兔ACL重建的实验研究
　　目的：将转染TGF-β3基因的BMSCs种植于蚕丝-胶原支架上，观察其用于兔ACL重建后关节腔内韧带再生和两端腱-骨愈合的情况。
　　方法：40只12周龄新西兰大白兔，随机平均分为4组进行双侧ACL重建:Auto组，以自体半腱肌肌腱重建ACL;S组，以单纯蚕丝-胶原支架重建ACL;S+C组，以BMSCs(转染GFP-Lentivirus，并稳定表达GFP)种植于蚕丝-胶原支架后用于ACL重建;S+C-T组，转染TGF-β3基因的BMSCs种植于蚕丝-胶原支架后用于ACL重建。术后2周、4周对实验动物的膝关节活动度(ROM)进行测量，术后2周对膝关节进行MRI扫描，观察关节腔内术后情况;术后4周、16周两个时间点分别随机处死每组实验动物的一半，每组标本中的5个进行组织学检测，包括关节腔内韧带的组织学检测和骨隧道腱-骨愈合情况的组织学监测;每组中余下5个标本进行micro-CT和生物力学检测。
　　结果：术后第2周，S组、S+C组、S+C-T组兔膝关节ROM明显优于Auto组;而第4周时，各组间ROM未见明显差异。MRI显示蚕丝-胶原支架在体内水分明显较自体韧带多。HE和免疫组织化学染色显示S+C-T组在16周时有更好的细胞排列和细胞外基质沉积;Russell-Movat染色显示S+C-T组在16周时腱-骨界面形成了典型的生理性腱-骨界面的四层结构，而S组和S+C组在腱-骨界面多形成伸入移植物的硬化骨小梁，而Auto组在腱-骨界面则观察到了典型的Sharpey's纤维。Micro-CT显示感兴趣区域(area of interesting，AOI)在4周和16周的骨形成指标(BV/TV，BMD)均显著高于Auto组，这和生物力学结果相一致。
　　结论：转染TGF-β3基因的BMSCs种植于蚕丝-胶原支架后用于兔ACL重建，不仅能获得较好的关节腔内韧带再生，同时能够达到良好的腱-骨愈合效果。
　　第四部分 两端负载羟基磷灰石的蚕丝-胶原支架用于兔ACL重建的实验研究
　　目的：用模拟体液结晶法将HA结合到蚕丝网片上，将两端负载HA的蚕丝-胶原支架用于兔ACL重建的实验研究，观察其腱-骨界面的愈合情况。
　　方法：用模拟体液结晶法将HA结合到蚕丝网片上，然后将网片和胶原溶液通过冷冻干燥和真空热交联法进行交联，制作两端负载HA的蚕丝-胶原支架材料。24只新西兰大白兔，随机平均分为2组进行左侧下肢ACL重建:S组，单纯蚕丝-胶原支架用于ACL重建;HA组，两端负载HA的蚕丝-胶原支架用于ACL重建。术后16周处死实验动物，收集标本，对ACL的远期效果进行评价:每组中6个标本进行HE和蕃红-O和免疫组织化学染色对腱-骨愈合进行评价;剩余6个标本进行micro-CT、生物力学以检测以及骨性关节程度的评分。
　　结果：术后第16周，组织学染色显示S组和HA组腱-骨界面可见骨小梁长入移植物内，而在HA组骨小梁长入更为明显，micro-CT矢状面上显示骨隧道内部有条状骨形成;免疫组化显示HA组在腱-骨界面有更多的collagenⅠ和osteocalcin的表达，而S组有更多collagenⅢ的表达，说明HA组腱-骨界面骨形成更早、更成熟。HA组Micro-CT显示感兴趣区域的骨形成指标(BV/TV，BMD)均显著高于S组，与生物力学结果相一致。对膝关节骨性关节炎评价结果显示HA组Mankin评分明显小于S组，进一步说明HA组ACL重建后膝关节较S组重建后更为稳定。
　　结论：两端负载HA的蚕丝-胶原支架用于ACL重建后虽未在腱-骨界面观察到典型的生理性腱-骨界面结构，但HA能在骨隧道内诱导骨长入移植物内从而形成稳定的腱-骨界面，对关节软骨的保护作用优于S组的蚕丝-胶原支架。植入过程较为简单，比蚕丝-胶原支架联合转染TGF-β3基因的BMSCs用于ACL重建更具有可操作性。

目录

声明

致谢

摘要

中英文缩略词表

1．绪论

1．1 ACL移植材料的现状

1．2 ACL组织工程和蚕丝-胶原支架

1．3 种子细胞和生长因子

1．4 羟基磷灰石

2．第一章 骨髓间充质干细胞分离、鉴定和病毒转染

2．1 引言

2．2 实验材料

2．3 试验方法

2．4 实验结果

2．5 讨论

2．6 结论

2．7 课题资助

3．第二章 蚕丝-胶原支架的制备和生物性能分析

3．1 引言

3．2 实验仪器和试剂

3．3 实验方法

3．4 实验结果

3．5 讨论

3．6 结论

3．7 课题资助

4．第三章蚕丝-胶原支架联合转染TGF-β3基因的BMSCs用于兔前交叉韧带重建

4．1 引言

4．2 实验材料和仪器

4．3 实验方法

4．4 实验结果

4．5 讨论

4．6 结论

4．7 课题资助

5．第四章 两端负载羟基磷灰石的蚕丝-胶原支架用于兔ACL重建的实验研究

5．1 绪论

5．2 实验材料和仪器

5．3 实验方法

5．4 实验结果

5．5 讨论

5．6 结论

5．7 课题资助

参考文献

综述 促进前交叉韧带重建后腱骨愈合方法的研究进展

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