ACL重建后TGF-β1/VEGF165共表达基因转染的BMSCs促进腱-骨愈合的研究

摘要

目的：探讨ACL重建术后以BMSCs为载体的TGF-β1/VEGF165共表达基因治疗是否可有效提高腱-骨隧道的新骨生成，促进腱-骨愈合，从而增强其生物力学强度。
　　方法：采用骨髓穿刺法获取兔骨髓，并用密度梯度离心法成功分离并体外培养骨髓间充质干细胞。将40只新西兰大白兔按照BMSCs是否接受TGF-β1/VEGF165共表达基因腺病毒分为两组，每组20只，每只兔行双侧前交叉韧带重建手术，用自体半腱肌腱为韧带移植物，在完成前交叉韧带重建手术后，实验组将经腺病毒转染稳定表达TGF-β1/VEGF165的骨髓间充质干细胞和生物蛋白胶混合后注入兔前交叉韧带重建模型的肌腱和骨隧道间隙内，对照组将混有骨髓间充质干细胞的生物蛋白胶注入肌腱和骨隧道间隙内。分别在6、12周时间点各组处死10只兔，其中4只兔取材后进行HE染色和天狼星红染色的组织学检查，6只兔进行生物力学检查，软件计算出最大载荷和刚度，记载失效点是股骨骨隧道附着部、胫骨骨隧道附着部或中间韧带，并于12周每组各取4只兔麻醉后进行影像学CT观察，观察骨隧道大小的改变和骨隧道密度改变。
　　结果：组织学检查结果中，术后6周时，实验组标本的腱-骨界面之间结合较密集，可见成纤维细胞和类软骨细胞，细胞排列不规整，一定量的新生血管，局部形成软骨组织移行带，已有Sharpey样纤维生成，而此时对照组标本的腱-骨界面之间可见成纤维细胞、间充质干细胞和炎性细胞，组织间血管含量较少，无明显腱-骨连接；术后12周时，实验组标本腱-骨界面之间结合紧密，软骨组织移行带逐渐形成，可见成熟软骨细胞，排列整齐，胶原纤维大量合成，可见新生血管和成骨细胞，腱-骨界面局部出现肌腱-纤维软骨-钙化软骨-骨组织的移行带，类似于正常前交叉韧带的止点结构，而此时对照组标本腱-骨界面可见成纤维细胞增生，Sharpey纤维增多，排列较整齐，局部腱-骨界面出现胶原纤维连接。生物力学测试，在术后6周时实验组和对照组肌腱移植物均从骨隧道中拔出，但实验组拔出力量较对照组增大；术后12周时，对照组有2例肌腱移植物从骨隧道中拔出，其余肌腱移植物均为中部断裂；通过t检验对术后第6周和第12周的实验组与对照组结果进行比较，实验组肌腱移植物的最大载荷和刚度较对照组明显增强，差异均有统计学意义(P<0.05)。影像学CT观察术后12周可见实验组与对照组骨隧道均无明显扩大，骨隧道及其边缘骨密度实验组较对照组明显增高。
　　结论：以BMSCs为载体的TGF-β1/VEGF165共表达基因治疗可以促进重建ACL移植物早期的血管生成和腱-骨隧道的新骨生成，从而使腱-骨愈合向直接愈合的方向发展，并最终取得良好的力学性能。