TNF-α诱导人类成纤维细胞DNA损伤及衰老的机制研究

摘要

细胞衰老是细胞生存过程中增殖能力和生理功能逐渐丧失最终走向死亡的一种反应，主要分为复制衰老和压力诱导的早衰。此过程不可逆转，期间细胞仍具有基本的代谢能力。引起衰老的因素有很多，例如端粒的缩短、DNA损伤、癌基因激活、炎症因子等化学刺激。目前，炎症因子诱导的细胞衰老正逐渐成为细胞衰老领域研究的新热点。TNF-α是一种重要的炎症因子，在诱导细胞凋亡、促进肿瘤坏死以及促进细胞增殖方面起着重要的作用，而随着研究的不断深入，TNF-α在细胞衰老方面的作用也越来越受到人们的关注。有研究认为，TNF-α可以通过上调细胞内ROS的水平造成DNA氧化损伤来诱导细胞衰老的发生，这可能是通过ATM通路介导的。另外，也有文献报道TNF-α可能直接通过p38/MAPK通路引起细胞p16INK4(a)的上调造成内皮细胞的衰老。虽然对于TNF-α诱导衰老的研究越来越多，但是，目前关于TNF-α诱导细胞衰老的具体机制并没有一个明确的答案，我们并不清楚DNA损伤与p38/MAPK之间存在怎样的关系，而且由于细胞类型的不同，可能TNF-α对它们的影响也不相同。因此，为了进一步探讨TNF-α诱导细胞衰老的机制，我们选取人类正常的成纤维细胞(HNF)作为研究对象，利用终浓度为10ng/mlTNF-α对其进行诱导，观察HNF的SA-β-gal阳性染色情况，发现经TNF-α处理6～9天，HNF细胞的SA-β-gal阳性细胞数量明显增多，说明TNF-α可以引起HNF细胞的衰老。然后通过Westernblotting、RealtimeRT-PCR等技术检测ATM通路、p38/MAPK通路以及与衰老相关的关键因子的表达情况，发现长时间的TNF-α处理可以上调HNF的γ-H2AX表达，并且可以引起p-Chk2的上调，同时TNF-α可以激活p38/MAPK，而且加入SB203580抑制p38/MAPK的活性可以减少SA-β-gal阳性细胞比例。TNF-α也可以引起HNF细胞p16INK4(a)和p21Cipl转录及蛋白水平的升高，加入SB203580可以下调两者的表达。但是，我们利用流式细胞术检测的细胞周期分布情况却与文献报道的衰老细胞的周期分布相反，即TNF-α处理后处于G0/G1期的细胞数减少，而S期明显增多。另外，我们发现TNF-α可能会诱导肿瘤细胞U2OS发生凋亡，因此，TNF-α诱导的细胞衰老取决于细胞类型。依据上述结果，我们认为TNF-α可以诱导HNF细胞发生衰老，并且可能是通过激活ATM和p38/MAPK通路介导的，但是ATM与p38/MAPK之间的具体关系仍不明确，需要实验验证;TNF-α可以引起21Cipl和p16INK4(a)的上调，从而诱导衰老的发生，这可能由p38/MAPK介导，而不受p53直接影响;这些变化都需要一个较长的诱导过程。体内炎症因子的减少可能会减缓衰老的进程，因此TNF-α对细胞衰老的影响可能为今后肿瘤的防治以及延缓衰老提供了新的思路。