慢加急性乙型肝炎肝衰竭患者GSTM3基因启动子甲基化状态及氧化损伤分析

摘要

第一部分慢加急性乙型肝炎肝衰竭患者GSTM3基因启动子甲基化状态分析
　　 慢加急性肝衰竭(acute-on-chronic liver failure，ACLF)是在慢性肝病基础上出现急性肝功能失代偿的临床表现，主要由感染、酒精、肝毒性药物等因素诱发，临床表现为高胆红素血症、凝血功能障碍，并发腹水、肝性脑病和（或）肝肾综合征以及多脏器功能衰竭等，全身血液动力学改变伴随ACLF的病情进展，其病理生理过程包括全身炎症反应综合征、炎症及氧化应激等，死亡率极高。在我国，引起ACLF的首要病因是乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)感染，由慢性乙型病毒性肝炎所致的ACLF称为慢加急性乙型肝炎肝衰竭(acute-on-chronichepatitis B liver failure，ACHBLF)，是我国最常见的肝衰竭类型，占80％～90％。在临床上ACHBLF缺乏特异、有效的治疗手段，病情凶险，进展迅速，绝大部分患者预后差。ACHBLF的发病机制尚不完全明确。
　　 DNA甲基化是转录水平的DNA修饰方式之一，发生在CpG岛上，它在调节基因表达及维持细胞正常分化中起着重要作用。目前认为DNA甲基化可抑制基因表达。甲基化程度高，基因表达降低。谷胱甘肽-S-转移酶M3（glutath(i)one-S-transferase M3，GSTM3）是谷胱甘肽-S-转移酶(glutathione-S-transferases，GSTs)超家族一种重要的同工酶，具有较强的抗氧化应激功能，是机体内抗氧化防御体系的重要成分之一，具备清除活性氧（或称氧自由基）(reactive oxygen species，ROS)的能力。GSTM3基因启动子发生甲基化时可导致该基因表达下调，造成其抗氧化功能下降，ROS在体内或细胞内蓄积，对肝脏的保护作用降低，可能会加重氧化损伤对肝功能的损害。
　　 基因启动子甲基化是目前研究的热点，在恶性疾病的早期诊断、风险评估、早期复发预测、治疗反应监测及预后判断中，异常的DNA甲基化位点已经成为最有前景的分子标志物之一。目前有关GSTs超家族成员GSTM3基因启动子甲基化的研究多侧重于与膀胱癌、肝癌、前列腺癌等肿瘤发生、发展的相关性。我国肝癌患者中约90％有HBV感染背景，但目前尚未见对慢性乙型肝炎(chronichepatitis B，CHB)，特别是重型肝炎患者进行该基因启动子甲基化检测的研究。
　　 目的:
　　 本研究的目的是检测ACHBLF患者是否存在GSTM3基因启动子区的甲基化异常并通过比较临床预后相关指标，评价其临床意义从而指导临床应用。
　　 方法:
　　 本研究采用病例对照研究设计，病例选自2009年12月至2011年2月在山东大学齐鲁医院住院及门诊就诊患者，其中ACHBLF组30例，CHB组30例;10名健康志愿者作为正常对照组。记录以上研究对象的年龄、性别等指标，收集肝功、肾功、凝血功能、HBV-DNA定量等临床指标并进行比较。用试剂盒提取外周血DNA，并用重亚硫酸盐法对其进行甲基化修饰。应用甲基化特异性聚合酶链反应(methylation-specific polymerase chain reaction，MSP)方法检测三组研究对象GSTM3基因的启动子甲基化状态并进行比较。根据检测结果将ACHBLF组分为甲基化组和非甲基化组，计算各组的终末期肝病模型(model forend-stage liver disease，MELD)积分及死亡率，通过比较进行临床预后评价。
　　 所有统计学处理采用统计软件SPSS13.0 for Windows分析。组间临床资料比较、MELD积分比较应用独立样本t检验，甲基化率的比较应用卡方检验，死亡率比较应用Fisher's确切概率法。P＜0.05定为差异有统计学意义。
　　 结果:
　　 1、ACHBLF组的血清谷丙转氨酶(alanine aminotransferase，ALT)水平(516.110±527.137 IU/L)明显高于CHB组(264.633±274.053 IU/L，P=0.024)，谷草转氨酶(aspartate aminotransferase，AST)水平(396.283±337.062 IU/L)明显高于CHB组（212.153±222.816 IU/L，P=0.016），总胆红素(total bilirubin，TBIL)水平(383.483±137.034μmol/L)明显高于CHB组(37.400±27.004μmol/L，P＜0.001)，凝血酶原活动度(prothrombin time activity，PTA)水平(31.187±8.013％)明显低于CHB组（90.000±9.766％，P＜0.001）。
　　 2、30例ACHBLF患者中9例检测到GSTM3基因启动子甲基化，比率为30％，30例CHB患者中2例检测到GSTM3基因启动子甲基化，比率为6.7％，两组比较差异有统计学意义(x2=5.455，P=0.020)。
　　 3、ACHBLF患者甲基化组的血清TBIL水平(527.922±113.564μmol/L)明显高于非甲基化组（321.581±93.048μmol/L，P＜0.001），PTA水平(24.811±10.697％)明显低于非甲基化组(33.919±4.604％，P=0.035)。
　　 4、ACHBLF患者甲基化组的MELD积分(22.706±2.669)明显高于非甲基化组(18.765±4.808，P=0.029)。ACHBLF患者有8人死亡，死亡率为26.7％，其中5人属于甲基化组，死亡率为55.6％，3人属于非甲基化组，死亡率为14.3％，甲基化组的死亡率明显高于非甲基化组(P=0.032)。
　　 结论:
　　 我们的研究结果首次表明ACHBLF患者存在GSTM3基因启动子甲基化的异常，启动子甲基化可能导致GSTM3基因表达下降，抑制其抗氧化功能，加重氧化损伤程度，在CHB进展为ACHBLF的过程中可能具有重要作用，检测该基因启动子甲基化状态可作为判断ACHBLF患者预后的重要指标。
　　 第二部分慢加急性乙型肝炎肝衰竭患者GSTM3基因启动子甲基化状态与氧化应激的相关性分析
　　 氧化应激是机体的氧化能力与抗氧化能力失衡，氧化程度超出氧化物质的清除能力，导致活性氧（或称氧自由基）(reactive oxygen species，ROS)在体内或细胞内蓄积而引起的细胞毒性，最终导致组织损伤的过程。氧化应激可直接或间接引起脂质、蛋白质、酶和DNA的氧化或损伤，诱发基因突变、蛋白质变性和脂质过氧化，与肿瘤、心脑血管疾病、糖尿病、各种肝病（包括病毒性肝炎、肝纤维化、肝癌）等多种疾病密切相关。肝脏含有丰富的线粒体，是ROS攻击的主要器官。线粒体呼吸链复合体利用电子传递生产三磷酸腺苷(adenosinetriphosphate, ATP)，是ROS的主要来源。氧化损伤可以加快肝脏病变的进展。
　　 慢加急性肝衰竭(acute-on-chronic liver failure，ACLF)是多种因素参与的复杂过程，炎症和氧化应激在其发生发展中起着重要作用。肝病时患者体内免疫功能紊乱，炎症反应增强，免疫复合物形成，补体活化及胶原纤维形成等均可刺激ROS生成增多，可引起肝细胞过氧化脂质形成。机体内ROS生成与清除处于失平衡状态持续时间越久，组织细胞抗氧化防御保护功能越弱，肝损伤程度越重。
　　 肝细胞氧化应激可导致细胞膜脂质过氧化，形成过氧化产物如丙二醛(malondialdehyde，MDA)、酮类、羟氢氧基等。MDA是脂质过氧化的主要代谢产物，是研究脂质过氧化并反映氧化损伤的重要生物标志物，体内MDA水平增高，提示存在氧化损伤;谷胱甘肽-S-转移酶(glutathione-S-transferase，GST)是一种抗氧化酶，它可修复ROS损伤的膜磷脂、抑制微粒体过氧化反应等，通过多种方式起到抗氧化作用。肝细胞受损时GST可以快速释放入血，血清GST活性测定是一项理想的反映肝细胞损害程度的指标，具有良好的特异性和敏感性。二者的水平变化可反映体内自由基产生和清除这一动态平衡过程。
　　 谷胱甘肽-S-转移酶M3（glutathione-S-transferase M3，GSTM3）基因表达的改变会影响GST的抗氧化功能。我们第一部分的研究结果首次表明慢加急性乙型肝炎肝衰竭（acute-on-chronic hepatitis B liver failure，ACHBLF）患者存在GSTM3基因启动子甲基化的异常，启动子甲基化可能导致GSTM3基因表达下降，抑制其抗氧化功能，加重氧化损伤程度，在慢性乙型肝炎(chronic hepatitisB，CHB)进展为ACHBLF的过程中可能具有重要作用，检测该基因启动子甲基化可作为判断ACHBLF患者预后的重要指标。
　　 目的:
　　 本研究的目的是通过检测血清MDA和GST表达水平，并与终末期肝病模型(model for end-stage liver disease，MELD)积分进行相关分析，探讨ACHBLF患者GSTM3基因启动子甲基化状态与氧化应激的关系，从而对ACHBLF的病情发展、评估预后及临床治疗提供理论基础。
　　 方法:
　　 应用甲基化特异性聚合酶链反应(methylation-specific polymerase chainreaction，MSP)检测GSTM3基因启动子甲基化状态，具体方法同实验第一部分，应用酶联免疫吸附测定(enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)技术检测CHB患者、ACHBLF患者血清MDA及GST的表达水平，并对ACHBLF患者进行MDA、GST水平与MELD积分的相关性分析。
　　 所有统计学处理采用统计软件SPSS13.0 for Windows分析。组间MDA及GST水平的比较应用独立样本t检验，应用Spearman's检验进行MDA、GST水平与MELD积分的相关性分析。P＜0.05定为差异有统计学意义。
　　 结果:
　　 1、ACHBLF组的血清MDA水平(13.045±5.416 pmol/mg)明显高于CHB组（9.387±5.332 pmol/mg,P=0.011）。
　　 2、ACHBLF甲基化组的血清MDA水平(16.956±2.155 pmol/mg)明显高于非甲基化组（11.369±5.553 pmol/mg，P＜0.001）。
　　 3、ACHBLF组的血清GST水平(1318.081±273.887 mIU/L)明显高于CHB组（666.832±181.267mIU/L,P＜0.001）。
　　 4、ACHBLF甲基化组的血清GST水平(1381.678±236.841mIU/L)与非甲基化组相比差异无统计学意义(1262.253±202.782mIU/L，P=0.170)。
　　 5、ACHBLF组的血清MDA水平与MELD积分呈正相关(r=0.588，P=0.001)，而血清GST水平与MELD积分无相关性(r=0.115，P=0.546)。
　　 结论:
　　 ACHBLF患者GSTM3基因启动子甲基化状态与氧化应激存在相关性，该基因启动子甲基化异常参与氧化应激对HBV感染患者的肝功能损害，并且氧化应激损伤程度与患者的病情严重程度成正相关，从而为抗氧化剂治疗ACHBLF提供理论依据。