噬尼古丁节杆菌产透明质酸酶条件优化及酶学性质研究

摘要

透明质酸酶是一组广泛存在于自然界的酶，在多种哺乳动物的器官组织及多种微生物中均发现透明质酸酶的存在。经文献查阅，约有四十几种的微生物可表达产生透明质酸酶。随着研究的进展，越来越多的细菌来源的透明质酸酶被探究发现，主要的研究方向是酶的分离纯化、克隆表达及性质探究等方面。本实验从被污染的透明质酸钠溶液中分离出一株菌，经16sRNA鉴定为噬尼古丁节杆菌，对该菌产透明质酸酶的能力、产酶条件及其酶学性质进行了研究，为探索新的透明质酸酶来源及其产业化应用提供依据。本论文的主要内容如下:
　　1、噬尼古丁节杆菌产透明质酸酶的鉴定。本实验筛选得到一株产透明质酸酶的菌株，经16sRNA鉴定为噬尼古丁节杆菌。并且利用四种方法对该菌株有降解透明质酸钠的能力进行了验证，表明其有产生透明质酸酶的能力。这四种方法是粘度法、高效液相色谱法、平板法、酶谱电泳法。粘度法检测到噬尼古丁节杆菌的发酵上清液可使透明质酸钠溶液的粘度明显下降。同时通过高效液相色谱法检测到粘度下降的过程中大分子量的透明质酸钠降解为小分子的糖片段。相较于上述两种方法，平板法比较直观的肉眼观察到透明质酸酶所引起的反应。酶谱电泳是对特定酶活性检测的一种有效方法，样品经活性电泳分离后，与含有酶底物-透明质酸钠的胶孵育，染色脱色后可明显看到酶作用的区域。
　　2、噬尼古丁节杆菌发酵产透明质酸酶的条件优化。以放线菌基础培养基高氏一号为基础，采用单因素实验的方法，对噬尼古丁节杆菌产透明质酸酶条件进行优化，以浊度法来测定不同实验条件下发酵液中透明质酸酶的活力。实验结果显示最佳N源是硝酸钾，C源是透明质酸钠，接种量是5％，温度是30℃，培养时间48h，最佳培养基初始pH是6.5。优化后酶的活性由5.82U/mL达到64.32U/mL。
　　3、透明质酸酶的分离纯化及酶学性质探究。该实验将发酵上清液用超滤管脱盐浓缩后得到的样品过DEAE-Sepharose离子柱层析，经过分离得到透明质酸酶的单一峰。进一步用非变性电泳法确定酶的位置后，收集含有蛋白的区域，对酶进行纯化。纯化后的蛋白经SDS-PAGE检测蛋白分子量在22.1kDa之间。以单一峰为样品，对酶液进行初步的酶学基本性质探究。实验结果显示酶的最适反应温度是37℃，该酶在温度较低条件下较为稳定，40℃以上时酶不稳定。酶的最适反应pH是7，在pH4-7的范围内酶的稳定性较高。随着环境中盐浓度升高，酶的活力和稳定性都会逐渐降低。酶的最适盐浓度是0.15M。在各类金属离子中，Ag+、Cu2+对酶的活性影响最大，均能导致酶完全丧失活性;Li+、Na+、Ca2+、Zn2+对酶活影响也较大，都能导致丧失部分酶的活性;金属离子中仅有Ba2+在50mM浓度下对酶活没有影响，100mM时能够提高酶的活性。