挣制PARp-1改善衰老导致的内皮细胞功能紊乱

摘要

研究背景:大量实验证实衰老导致的内皮细胞功能失调与活性氧(ROS)和活性氮（RNS）的过度产生和一氧化氮生物利用度降低有关。氧化应激最大的危害是损伤细胞DNA而且还能激活聚二磷酸腺苷核糖聚合酶-1（PARP-1）。持续氧化应激引起的DNA损伤可以导致PARP-1的过度激活。近期有实验表明PARP-1参与炎症反应。PARP-1的过度表达提示存在DNA损伤，这与内皮细胞功能失调有着紧密联系，但迄今为止，关于PARP-1和衰老内皮细胞功能联系的研究罕有报道，本研究利用自然衰老的小鼠，探讨抑制PARP-1在保护衰老内皮细胞功能中的作用。
　　研究目的:
　　1.探讨抑制PARP-1对衰老内皮功能的影响
　　2.探讨抑制PARP-1改善内皮细胞功能的机制
　　研究方法:
　　1.动物模型的建立
　　野生型雄性小鼠和PARP-1基因敲除小鼠分别被分成年轻组（2个月）和衰老组（12个月）并测量相关生化指标。
　　2.动物血管功能检测
　　把主动脉切成3mm-4mm的动脉环，每个环都连接到等力测距传感器上。血管环被去甲肾上腺素预先刺激，之后测定对乙酰胆碱和硝普钠的反应。
　　3.实时定量PCR
　　提取主动脉组织RNA并逆转录成cDNA，进行实时定量PCR，测定β-actin， PARP-1，eNOS，iNOS，Arg2的mRNA水平。
　　4.细胞培养以及衰老细胞模型的建立
　　使用AngⅡ刺激入主动脉内皮细胞诱导衰老，使用LY294002，BAY11-7082，和DPQ来抑制Akt，NF-κB and PARP-1的活性。使用β半乳糖甘酶染色来检测衰老模型。
　　5.蛋白印迹
　　提取各组细胞与各组组织的总蛋白，分别检测PARP-1，p-eNOS，eNOS，iNOS，AKT，p-AKT，p16，p21等蛋白的表达量。
　　6.NO水平及ROS水平检测
　　动物血清NO水平使用NO检测试剂盒及分光光度计进行检测和测量。主动脉和细胞ROS水平使用DHE染色试剂盒和DCFH-DA染色试剂盒进行测定。
　　7.免疫荧光
　　使用免疫荧光技术检测NF-kb的核转位情况。
　　8.使用spss12进行数据统计处理，用均数±标准差的形式表示（mean±SD）。
　　研究结果:
　　1.PARP-1在不同年龄的小鼠中的表达变化:
　　在野生型小鼠中，衰老组PARP-1表达水平升高，而PARP-1敲除组中则几乎没有表达。
　　2.衰老组血管功能的改变:
　　野生型衰老小鼠主动脉对乙酰胆碱的敏感性明显下降，而敲除PARP-1的衰老小鼠能明显改善主动脉对乙酰胆碱的敏感性，但是它们对硝普钠的反应却没有统计学意义。
　　3.小鼠血NO水平及主动脉组织ROS水平检测:
　　相对于野生型年轻小鼠，野生型衰老小鼠NO水平、ROS水平明显下降，敲除PARP-1后能改善这种变化。
　　4.小鼠主动脉组织eNOS，p-enos(Thr454)，iNOS及Arg2的蛋白表达:
　　相对于野生型年轻小鼠，野生型衰老小鼠iNOS及Arg2的蛋白表达增高，敲除PARP-1后能改善这种变化，但是eNOS却没有改变。之后测定了p-enos(Thr454)的表达，与野生型年轻小鼠相比，野生型衰老小鼠p-enos(Thr454)的蛋白表达降低，敲除PARP-1后同样也能改善这种变化。
　　5.衰老细胞模型的建立及检测衰老细胞PARP-1的表达:
　　使用AngⅡ诱导主动脉内皮细胞，β半乳糖苷酶和P16 P21检测模型建立，发现AngⅡ诱导的细胞β半乳糖苷酶和P16 P21的表达显著升高，说明模型建立成功。与正常细胞相比，AngⅡ诱导的细胞PARP-1表达升高。
　　6.检测细胞ROS水平和NO水平:
　　AngⅡ诱导的细胞ROS表达增高而上清液NO水平下降。
　　7.AngⅡ通过AKT通道改变PARP-1的表达:
　　同时用AngⅡ和AKT通道抑制剂刺激细胞比单独使用AngⅡ刺激细胞，PARP-1的表达降低程度更明显。
　　8.PARP-1抑制剂和NF-kb抑制剂能减少iNOS的表达增加P-eNOS(Thr454)的表达:
　　与单独使用AngⅡ刺激细胞相比，同时用AngⅡ与PARP-1抑制剂和AngⅡ与NF-kb抑制剂刺激细胞后iNOS的表达明显降低，但是对eNOS的表达没有显著影响， P-eNOS(Thr454)的表达显著升高。
　　9.PARP-1抑制剂通过阻止NF-kb的核转位减少iNOS的表达:
　　免疫荧光显示AngⅡ能诱导NF-kb的核转位，但是加入了PARP-1抑制剂后能阻止NF-kb核转位的发生。
　　研究结论:
　　1.PARP-1抑制剂能通过调节iNOS的表达来改善衰老引起的内皮细胞功能的失调；
　　2.抑制PARP-1的表达也许会成为治疗衰老血管功能失调的新的方向。

目录

声明

摘要

符号说明

前言

1 材料与方法

1．1 实验对象

1．2 使用仪器

1．3 使用试剂

1．4 实验方法和步骤

2 实验结果

2．1 各组小鼠检测的基本指标及衰老小鼠模型的建立

2．2 野生型衰老小鼠的PARP-1的表达升高，而敲除PARP-1的小鼠PARP-1几乎无表达

2．3 PARP-1的敲除可以改善衰老小鼠主动脉血管的舒张功能

2．4 衰老可使NO的产生水平下降，小鼠PARP-1敲除可以改善这种变化

2．5 小鼠PARP-1敲除可以改善衰老造成的氧化应激

2．6 小鼠PARP-1敲除可以改善衰老造成的与NO合成相关酶类的表达的改变

2．7 衰老细胞模型的建立

2．8 PARP-1抑制剂(DPQ)可以改善细胞衰老造成的氧化应激和NO表达水平的下降

2．9 AngⅡ诱导的衰老细胞PARP-1的表达升高

2．10 AKT通道参与了衰老细胞PARP-1表达的改变

2．11 抑制PARP-1和NF-κB可以减少炎症因子的iNOS的表达并增加p-eNOS(Thr454)的表达但是对eNOS的表达没有影响

2．12 PARP-1抑制剂能显著改善因衰老造成iNOS的表达增加和p-eNOS(Thr454)的表达减少通过减少NF-κB P65的核转录活性

3 讨论

创新点与局限性

创新点

局限性

4 结论

附录

参考文献

致谢

攻读硕士期间撰写与发表的论文