APJ受体羧基末端磷酸化位点对G蛋白非依赖信号途径的影响

摘要

研究背景及目的：
　　G蛋白偶联受体(G protein-coupled receptors，GPCRs)是目前已知最大的细胞膜表面受体超家族，可将胞外的多种信号分子（如气味、光、多肽、脂质、激素等）传至细胞内部，从而调节和维持生物体的稳态。GPCRs在人体内广泛表达，其信号传导通路的失调与多种疾病的发生发展密切相关。目前，临床上超过50％的药物以GPCRs作为靶点。
　　本研究旨在阐明APJ羧基末端确切的磷酸化位点，观察这些位点对APJ受体的脱敏、内吞和G蛋白非依赖的信号途径的影响，进而为心血管系统药物的筛选提供新的实验依据和思路。
　　研究方法：
　　1.细胞培养和转染:
　　采用人胚胎肾细胞(HEK293)作为研究对象;脂质体Lipofectamine2000为转染试剂转染细胞。
　　2.质谱检测:
　　提取APJ受体蛋白，通过烷基化和富集处理后，LC-MS/MS质谱分析APJ受体的磷酸化位点。
　　3.点突变及真核表达载体的构建:
　　重叠延伸PCR技术将APJ受体羧基末端335、345和348位点的丝氨酸(S)用丙氨酸(A)替代;限制性内切酶EcoRⅠ和XhoⅠ双酶切扩增产物和载体、连接、转化、质粒提取、酶切鉴定、基因测序鉴定，构建人APJ受体羧基末端磷酸化位点突变的真核表达载体。
　　4.酶联免疫吸附实验:
　　检测细胞膜表面野生型APJ受体及APJ突变体的表达量;检测细胞内cAMP的含量。
　　5.放射性配体结合实验:
　　检测野生型APJ受体或构建的APJ突变体与配体的结合力。
　　6.激光共聚焦共聚焦实验:
　　检测野生型APJ受体及APJ突变体在细胞膜表面的定位及受体内吞过程。
　　7.剂量反应和实时动态BRET实验:@检测野生型APJ受体或APJ突变体与GRK2/5或β-arrestin1/2相互作用的剂量反应和实时动态关系。
　　8.免疫共沉淀实验:
　　检测APJ受体与β-arrestin1或β-arrestin2之间的相互作用。
　　9.细胞内钙离子检测实验:
　　Fluo-4 NW检测激动剂刺激对细胞内钙离子含量变化的影响。
　　10.Western blot实验:
　　检测激动剂对细胞内ERK1/2磷酸化水平的影响。
　　11.统计学分析:
　　所有数据采用均数±标准误（Mean±SEM）表示，采用GraphPad Prism5.0软件进行统计学分析。
　　研究结果：
　　1.APJ受体羧基末端磷酸化位点的鉴定
　　NetPhos2.0分析软件预测APJ受体蛋白序列的磷酸化位点分别为ser335、ser345和ser348。随后，质谱分析法明确apelin-13刺激后，APJ受体确定的磷酸化位点为ser345和ser348。
　　2.APJ受体突变体真核表达载体的构建
　　将APJ受体羧基末端335、345和348位点的丝氨酸(S)用丙氨酸(A)替代。构建人APJ受体羧基末端磷酸化位点突变的真核表达载体，测序证实突变体重组质粒构建正确。
　　3.野生型APJ受体和APJ受体突变体的亚细胞定位分析
　　ELISA和BRET实验发现APJ-S335A、APJ-S345A和APJ-S348A突变体与野生型APJ受体表达量相当，点突变对APJ受体的细胞膜表面表达没有产生明显的影响，差异无统计学意义。
　　4.野生型APJ受体或APJ受体突变体对配体结合力的影响
　　放射配体结合分析技术证实APJ受体羧基末端磷酸化位点的突变并不影响配体的结合。至少，ser335、345和348并不是apelin-13结合的关键位点。
　　5.野生型APJ受体和APJ受体突变体的功能鉴定
　　稳定表达野生型APJ受体或APJ受体突变体的HEK293细胞中，APJ-S335A、APJ-S345A和APJ-S348A三种突变体都以剂量依赖性的方式抑制了弗司可林(forskolin，FSK)诱导的cAMP生成。同样，apelin-13均能诱导三种突变体胞内Ca2+释放的显著性增加，与野生型APJ受体基本一致。
　　6.APJ受体丝氨酸348位点对apelin-13诱导的受体内吞的影响
　　在稳定表达APJ受体的HEK293细胞，apelin-13(100nM)刺激5min后受体内吞开始。激动剂作用30min，大约有50％的受体离开细胞膜表面发生内吞。激动剂持续60min后，大约70％的受体回到细胞膜表面。与野生型APJ受体比较，apelin-13诱导的APJ-S335A和APJ-S345A突变体内吞没有发生明显改变。然而，ser348位点的突变使受体的内吞作用受到明显抑制。
　　激光共聚焦实验发现，野生型APJ受体和APJ-S335A、APJ-S345A、APJ-S348A突变体清晰的表达在细胞膜的表面。激动剂的作用下，APJ-S335A和APJ-S345A突变体的内吞过程与野生型受体相似。然而，在apelin-13的刺激下，APJ-S348A突变体失去了向胞浆移位的能力，不能与胞浆中的β-arrestin1或β-arrestin2蛋白发生共定位。
　　7.APJ受体丝氨酸348位点对GRK2/5或β-arrestin1/2募集的影响
　　BRET2检测apelin-13对APJ与GRK2/5相互作用的剂量反应关系。研究表明，GRK2被招募到激动剂活化的受体。EC50值分别为:6.58±0.58nM(WTAPJ)，6.20±1.56nM(APJ-S335A)，5.69±1.42nM(APJ-S345A)。同样，APJ与GRK5相互作用的EC50值分别为:9.45±2.58nM(WTAPJ)，8.20±1.85nM(APJ-S335A)，7.34±1.17nM(APJ-S345A)。然而，在不同浓度激动剂的作用下，APJ-S348A突变体均失去了与GRK2或GRK5相互作用的能力。
　　BRET1检测apelin-13对APJ与β-arrestin1/2相互作用的剂量反应关系。研究表明，β-arrestin1与野生型受体或突变体相互作用的EC50值分别为:5.69±0.71nM(WTAPJ),5.06±1.05nM(APJ-S335A),5.55±0.94nM(APJ-S345A)。β-arrestin2与野生型受体或突变体相互作用的EC50值分别为:8.29±1.25nM(WTAPJ),7.25±0.73nM(APJ-S335A),7.55±1.03nM(APJ-S345A)。 APJ-S348A突变体均失去了与β-arrestin1或β-arrestin2相互作用的能力。
　　免疫共沉淀实验发现只有在FLAG-β-arrestin1（或FLAG-β-arrestin2）和HA-APJ共转染的细胞样品中，显示出HA抗体沉淀下来的抗FLAG抗体反应的条带。而在FLAG-β-arrestin1（或FLAG-β-arrestin2）和HA-APJ-S348A共转染的细胞样品及对照组中，均未发现HA抗体沉淀下来的抗FLAG抗体反应免疫条带。
　　浓度依赖的ERK1/2磷酸化实验显示:不同浓度的apelin-13作用15min，HEK293-APJ绌胞表现出浓度依赖的ERK1/2磷酸化。然而，激动剂作用HEK293-APJ-S348A细胞相同的时间，各种浓度的apelin-13均未诱导出ERK1/2的磷酸化。继而缩短激动剂的作用时间，观察apelin-13刺激5min，HEK293-APJ细胞和HEK293-APJ-S348A细胞引起ERK1/2磷酸化的剂量依赖关系，结果并未发现两组绌胞表现出统计学的差异。
　　PTX预处理阻断Gαi/o蛋白后，结果发现HEK293-APJ细胞和HEK293-APJ-S348A细胞，apelin-13诱导的ERK1/2磷酸化均表现出明显的降低。
　　转染特异的shRNA抑制胞内的β-arrestin表达，观察apelin-13诱导的ERK1/2磷酸化过程。结果发现，转染shRNA对照组的HEK293-APJ细胞，apelin-13诱导的ERK1/2磷酸化与未转染组完全一致。然而，HEK293-APJ细胞分别转染β-arrestin1 shRNA或β-arrestin2 shRNA，apelin-13作用15min后的ERK1/2磷酸化水平明显降低。HEK293-APJ348细胞中转染β-arrestin shRNA后，apelin-13诱导的晚期ERK1/2磷酸化同样处于极低的水平，与野生型受体比较无显著性差异。
　　结论：
　　APJ受体的348位氨基酸是GRKs和β-arrestin结合的关键位点，其突变影响了受体的脱敏、内吞、复敏过程以及G蛋白非依赖的ERK1/2磷酸化。然而，APJ受体ser348位点的突变并不影响G蛋白的活化以及G蛋白下游的信号通路。因此，APJ-S348A突变体表现出偏向性受体的特性，其产生的偏向性信号有助于新的药物设计和研发。

目录

声明

摘要

缩写说明

文献综述

前言

材料与方法

结果

讨论

结论

附图

参考文献

Effects of APJ Carboxyl Terminal Phosphorylation Site on G Proein—independent Biased Signaling

攻读学位期间发表的学术论文

致谢