VASP磷酸化及其磷酸化位点突变对细胞迁移的影响

摘要

目的：血管扩张刺激磷蛋白（Vasodilator-stimulated phosphoprotein，VASP）是一种重要的肌动蛋白骨架调节蛋白，它参与调节肌动蛋白丝的组装和集聚，在与肌动蛋白骨架调节有关的各种细胞功能中发挥了重要作用。VASP 磷酸化是调节其自身功能的关键环节。但是，VASP 磷酸化在细胞迁移中的确切作用还不完全清楚。VASP有三个磷酸化位点Ser157、Ser239及Thr278，分别受到PKA/PKG的信号调节。其中Ser157、Ser239位点的磷酸化与VASP功能的调节密切相关。本实验通过观察VASP在PDGF诱导细胞迁移中的表达和分布，及VASP Ser157和 Ser239位点突变对细胞迁移的影响，探讨VASP磷酸化对细胞迁移中的影响及各磷酸化位点的确切作用。rn 方法：rn 1. PDGF 诱导细胞发生迁移，采用细胞划痕损伤实验和Giemsa 染色观察迁移情况；采用Western blot 法检测VASP总蛋白表达和VASP Ser157磷酸化的表达量；用免疫荧光检测迁移细胞内肌动蛋白骨架和VASP的分布情况。rn 2. 分别将VASP Ser157和Ser239磷酸化位点突变质粒及对照组用脂质体转染ECV304 细胞株，转染24-48小时后用Western blot 法分别检测VASP 磷酸化位点突变效果，通过transwell小室跨膜迁移实验观察各实验组对PDGF诱导20h 后细胞迁移的影响。rn 结果：rn 1. PDGF诱导细胞向划痕区域发生明显迁移，迁移前缘的细胞向前方伸长，形成宽大的细胞突起结构。免疫荧光检测进一步发现，PDGF刺激细胞骨架发生重排，细胞内出现粗大的肌动蛋白纤维丝，主要分布于沿迁移方向伸出的片状伪足上。VASP也由散在的点状分布转移到肌动蛋白纤维丝的末端，大部分聚集在细胞片状伪足的前缘。迁移细胞内VASP的总蛋白表达增加，VASP Ser157磷酸化水平增高。rn 2. 转染VASP Ser157位点突变体的ECV304细胞内，VASP Ser157磷酸化表达显著减少，VASP Ser239磷酸化表达无明显变化；转染VASP Ser239位点突变体的ECV304细胞内，VASP Ser239磷酸化表达显著减少，VASP Ser157磷酸化表达无明显变化。跨膜迁移实验结果显示，分别转染这两种突变体的ECV304细胞跨膜迁移的数量都明显减少，但VASP Ser157 突变体转染组与Ser239 突变体转染组的的迁移细胞数量无明显差异性。rn 结论：rn 1. VASP磷酸化正向调控细胞迁移 rn 2. VASP Ser157和Ser239位点磷酸化均介导细胞迁移。