大黄素通过ILK通路调控上皮性卵巢癌细胞迁移、侵袭及其机制的实验研究

摘要

研究背景:上皮性卵巢癌(EOC)是死亡率最高的妇科恶性肿瘤。由于卵巢癌早期症状不典型并且缺乏有效的早期检测指标导致多数患者确诊时已为疾病的晚期并伴随远处转移。虽然广泛转移卵巢癌的主要致死原因，但是发生转移的潜在的分子机制还没有完全阐明。最近的研究发现上皮间质转化(EMT)与卵巢癌发生转移有密切的联系。
　　整合素连接激酶(ILK)是一种丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶。它最初是因为与β1和β3整合素亚单位结合被发现的。整合素连接酶在通过整合素通路来调节多种细胞的增殖，迁移上发挥着重要的作用。ILK一旦被激活，直接使得包括糖原合成酶激酶-3β(GSK-3β)和蛋白激酶B(PKB/Akt)在内的多个重要的信号分子磷酸化进而影响细胞的增殖，周期，粘附及细胞外基质。ILK的表达水平在多种人类恶性肿瘤中都是上调的并且与肿瘤的分期和分级具有相关性。此外，有研究证明ILK可以通过诱导肿瘤细胞的EMT过程来促进肿瘤细胞的迁移和侵袭。大黄素（1，3，8-三羟基-6甲基蒽醌）是一种是从大黄，芦荟等植物的根茎中提取出来的蒽醌类的衍生物。已知大黄素对肿瘤细胞的增殖，肿瘤的发生，血管再生及肿瘤转移具有抑制作用。最近的研究表明，大黄素可以通过WNT/β-catenin通路抑制多种肿瘤细胞的EMT。同时，之前的研究也证实大黄素通过调节ILK通路促进人类子宫内膜间质细胞的间质上皮转化(MET)，从而抑制子宫内膜间质细胞的迁移和侵袭的能力。
　　目的:本研究旨在探讨大黄素是否能通过抑制EMT来抑制EOC细胞迁移和侵袭并探索在细胞及裸鼠移植瘤内的作用机制。
　　方法:
　　1.用CCK-8法检测不同浓度大黄素分别作用24小时，48小时和72小时对卵巢癌细胞系（A2780和SK-OV-3）增殖的影响。
　　2.Transwell迁移和侵袭实验用来检测A2780和SK-OV-3细胞的侵袭和迁移能力。
　　3.Western-blot和免疫组化(IHC)检测EOC细胞和移植瘤中上皮表型分子(E-cadherin和Claudin)，间质表型分子(N-cadherin和Vimentin)以及ILK信号通路相关蛋白的表达水平。
　　4.小干扰RNA(SiRNA)-ILK和SiRNA-Slug分别用来敲除A2780细胞和SK-OV-3细胞中ILK和Slug的表达。ILK慢病毒(pLVX-C1-ILK)用来建立ILK稳定过表达EOC细胞系。
　　结果:
　　1.大黄素对EOC细胞增殖，迁移和侵袭能力的影响大黄素对SK-OV-3细胞和A2780细胞具有抑制其增殖作用且呈浓度和时间依赖性。大黄素作用48小时后，SK-OV-3细胞和A2780细胞的迁移和侵袭能力都明显减弱。
　　2.大黄素对EOC细胞中EMT相关分子及Slug表达水平的影响Western-blot结果表明在大黄素的作用下SK-OV-3细胞和A2780细胞上皮表型分子（E-cadherin和Claudin）的表达上调而间质表型分子(N-cadherin和Vimentin)和转录因子(Slug)的表达下调，且呈浓度依赖性。转染siRNA-Slug到SK-OV-3细胞和A2780细胞中，N-cadherin和Slug的表达降低而E-cadherin的表达增高。siRNA-Slug转染后再加入emodin组的SK-OV-3细胞和A2780细胞的迁移和侵袭能力最弱。
　　3.大黄素对EOC细胞中ILK信号通路相关分子表达的影响SK-OV-3细胞和A2780细胞在大黄素作用48小时后ILK，p-GSK-3β，β-catenin和Slug的表达减少并呈浓度依赖性。
　　4.大黄素通过调控ILK抑制EOC细胞发生EMT的验证siRNA-ILK转染后，SK-OV-3细胞和A2780细胞ILK，p-GSK-3β，β-catenin和Slug的表达与对照组相比也降低。同时，E-cadherin的表达上调而N-cadherin的表达下调。并且siRNA-ILK转染后加用大黄素组与单独大黄素组或单独siRNA-ILK转染组相比ILK，p-GSK-3β，β-catenin，Slug和N-cadherin的表达更低，E-cadherin的表达更高。
　　5.大黄素通过调节ILK/GSK-3β通路抑制EOC细胞的EMT的验证SB216763（GSK-3β抑制剂）处理后除ILK的表达没有显著变化外，p-GSK-3β，β-catenin和Slug的表达均明显增强。同时，E-cadherin的表达量减少而N-cadherin的表达量增加。所以，大黄素可以逆转SB216763对SK-OV-3细胞和A2780细胞的作用。
　　6.大黄素对ILK过表达后SK-OV-3和A2780细胞迁移和侵袭能力的影响过表达ILK可以增强A2780和SK-OV-3细胞的迁移和侵袭能力。大黄素(20μM)可以抑制ILK过表达引起的EOC细胞迁移和侵袭能力的增强且大黄素可以抑制ILK过表达所导致的E-cadherin，Vimentin，MMP-9和Slug表达水平的变化。
　　7.大黄素对裸鼠体内肿瘤生长速度的影响pLVX-ILK组裸鼠的移植瘤体积增长与pLVX-Con组裸鼠相比明显迅速，但pLVX-ILK+emodin裸鼠组与pLVX-ILK+溶剂组裸鼠相比体积增长显著减慢。
　　8.大黄素对裸鼠移植瘤中EMT相关分子表达的影响pLVX-ILK+溶剂组与对照组相比移植瘤中E-cadherin表达下降;ILK，Slug，MMP-9和Vimentin的表达水平升高。而pLVX-Con+emodin组与对照组相比E-cadherin表达水平升高;ILK，Slug，MMP-9和Vimentin的表达水平降低。
　　9.大黄素对裸鼠肝肾及心功能的影响腹腔注射大黄素(50mg/kg)对裸鼠肝肾及心脏没有明显的毒性作用。
　　结论:
　　1.大黄素可以抑制SK-OV-3细胞和A2780细胞的增殖，迁移和侵袭能力。
　　2.大黄素通过调节ILK/GSK-3β/Slug信号通路抑制发生上皮间质转化(EMT)进而抑制SK-OV-3细胞和A2780细胞的迁移和侵袭能力。
　　3.大黄素可以抑制裸鼠卵巢癌移植瘤的生长及转移。
　　4.大黄素对裸鼠的肝肾及心功能没有明显的影响。

目录

声明

摘要

符号说明及缩略语表

前言

材料与方法

1．材料

2 实验方法

实验结果

3．大黄素对EOC细胞中ILK信号通路相关分子表达的影响

6．大黄素对ILK过表达后SK-OV-3和A2780细胞迁移和侵袭能力的影响

7．大黄素对裸鼠体内肿瘤生长速度的影响

8．大黄素对裸鼠移植癌中EMT相关分子表达的影响

9．大黄素对裸鼠肝肾及心功能的影响

讨论

结论

附图

参考文献

致谢

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