Periostin及大黄素通过ILK通路调控子宫内膜异位症迁移、侵袭能力的作用及机制研究

摘要

本文分为以下几个部分进行探讨：
　　第一部分 Periosin调控ILK通路促进子宫内膜间质细胞发生迁移、侵袭的作用及机制研究
　　目的:
　　1.检测Periostin在子宫内膜异位症患者在位和异位内膜间质细胞中的表达;
　　2.探讨Periostin对子宫内膜间质细胞增殖、黏附、迁移和侵袭能力的影响及其作用机制。
　　方法:
　　采用分离法原代培养人子宫内膜间质细胞(ESCs)，包括对照组子宫内膜间质细胞(CSCs)、内异症患者在位子宫内膜间质细胞(EuSCs)和异位子宫内膜间质细胞(EcSCs)。Real-time PCR和western blot分别检测子宫内膜异位症患者在位和异位内膜间质细胞中Periostin的表达。Western blot检测CSCs、EuSCs和EcSCs中ILK和p-Akt的表达水平。Transwell试验检测CSCs、EuSCs和EcSCs的迁移和侵袭能力。干扰EcSCs中Periostin的表达后，real-time PCR和western blot分别检测siRNA-ILK的干扰效率;westernblot检测干扰前后EcSCs中ILK、p-Akt的表达变化;MTT试验、细胞黏附试验、transwell试验分别检测转染前后EcSCs增殖、黏附、迁移和侵袭能力的改变。
　　结果:
　　1.ESCs的鉴定及纯度检测:成功分离并培养人ESCs，且细胞的纯度为96.5％±2.5％。
　　2.Periostin、ILK和p-AKT在ESCs中的表达:EuSCs和EcSCs较CSCs中Periostin的mRNA及蛋白表达水平明显升高，且EcSCs中表达水平最高（蛋白水平:EuSCs vs CSCs P＜0.05，EcSCs vs CSCs P＜0.001;mRNA水平:EuSCs vsCSCsP＞0.05，EcSCs vs CSCsP＜0.05);增殖期内膜较分泌期内膜中Periostin的蛋白表达水平稍高，但差异无统计学意义(P＞0.05)。此外，EuSCs和EcSCs较CSCs中ILK和p-Akt的表达在蛋白水平上明显升高(P＜0.05)，EuSCs和EcSCs中表达无明显差异(P＞0.05)。
　　3.Periostin对ESCs中ILK和p-AKT表达的影响:siRNA-Periostin转染后，EcSCs中Periostin的表达水平明显下降(P＜0.05)，EcSCs中ILK和p-Akt的表达水平亦明显下降(P＜0.05)。
　　结论:
　　1.Periostin能够明显增强子宫内膜间质细胞的黏附、迁移和侵袭能力，对细胞的增殖能力无明显影响。
　　2.Periostin通过调控ILK通路增强子宫内膜间质细胞的黏附、迁移和侵袭能力进而促进内异症的发生发展。
　　第二部分 Periosin调控ILK通路诱导子宫内膜腺上皮细胞发生上皮间质转化的作用及机制研究
　　目的:
　　1.检测Periostin对子宫内膜腺上皮细胞迁移和侵袭能力的影响;
　　2.探讨Periostin诱导子宫内膜腺上皮细胞发生上皮间质转化(EMT)的作用及机制。
　　方法:
　　采用分离法原代培养人子宫内膜腺上皮细胞(EECs);transwell细胞迁移和侵袭试验检测不同浓度Periostin作用前后细胞迁移和侵袭能力的改变;westernblot检测不同浓度Periostin作用前后细胞中E-cadherin、keratin、N-cadherin、vimentin、ILK、p-Akt、Slug和Zeb1的表达变化;siRNA干扰EECs中ILK的表达，westemblot检测干扰前后细胞中ILK、E-cadherin、keratin、N-cadherin、vimentin、p-Akt、Slug和Zeb1的表达;Periostin作用于siRNA-ILK干扰后的EECs，检测作用前后细胞中上述相关指标的变化。
　　结果:
　　1.EECs的鉴定及纯度检测:成功分离并培养人EECs，且细胞的纯度为95.6％±3.5％。
　　2.Periostin对EECs迁移和侵袭能力的影响:Periostin（20ng/ml和40ng/ml）作用于EECs48小时后，细胞的迁移和侵袭能力明显增强（迁移能力:20ng/ml P＜0.01，40ng/ml P＜0.001;侵袭能力:20ng/mlP＜0.05，40ng/mlP＜0.01）。
　　3.Periostin对EECs中EMT相关蛋白、ILK及p-Akt表达的影响:Periostin作用于EECs48小时后，E-cadherin和keratin表达下调，而N-cadherin和vimentin表达上调;且Periostin40ng/ml组结果具有统计学意义(P＜0.05)。此外，Periostin作用后，EECs内ILK、p-Akt、slug和Zeb1的表达水平均升高;且Periostin40ng/ml组结果具有统计学意义（P＜0.05）。
　　结论:
　　1.Periostin能够增强子宫内膜腺上皮细胞的迁移和侵袭能力。
　　2.Periostin能够诱导子宫内膜腺上皮细胞发生EMT。
　　3.Periostin通过激活ILK通路诱导EECs发生EMT。
　　第三部分 大黄素调控ILK通路诱导子宫内膜间质细胞发生间质上皮转化在抑制细胞迁移和侵袭能力中的作用及机制研究
　　目的:
　　1.检测子宫内膜异位症患者在位和异位内膜间质细胞中ILK的表达及细胞的迁移和侵袭能力;
　　2.探讨大黄素对子宫内膜间质细胞增殖、迁移和侵袭能力的影响;
　　3.探讨大黄素诱导子宫内膜间质细胞发生间质上皮转化(MET)的作用及机制。
　　方法:
　　采用分离法原代培养人子宫内膜间质细胞(ESCs)，包括对照组子宫内膜间质细胞(CSCs)、内异症患者在位子宫内膜间质细胞(EuSCs)和异位子宫内膜间质细胞(EcSCs)。Western blot分别检测CSCs、EuSCs和EcSCs中ILK的表达水平。Transwell试验分别检测CSCs、EuSCs和EcSCs的迁移和侵袭能力。浓度梯度大黄素作用于EcSCs后，MTT试验和transwell试验分别检测作用前后细胞增殖、迁移和侵袭能力的改变。浓度梯度大黄素作用于EcSCs后，western blot检测作用前后细胞中E-cadherin、keratin、N-cadherin和vimentin的变化。siRNA转染干扰EcSCs中ILK的表达，质粒转染过表达CSCs中ILK的表达;western blot分别检测转染前后EcSCs和CSCs中ILK、E-cadherin、keratin、N-cadherin和vimentin的表达;transwell试验分别检测转染前后EcSCs和CSCs迁移和侵袭能力的改变。大黄素作用于转染前后的ESCs，检测作用前后细胞中上述指标的变化。
　　结果:
　　1.ESCs中ILK的表达及细胞迁移和侵袭能力的检测:EuSCs和EcSCs中ILK的表达水平较CSCs中明显上调，其中，EcSCs中ILK的表达水平最高(EuSCs vsCSCs:P＜0.01;EcSCs vs CSCs:P＜0.001)。细胞形态方面，与CSCs相比，EuSCs和EcSCs在形态上更加细长，更趋近于梭形细胞。EuSCs和EcSCs的迁移和侵袭能力均较CSCs显著增强;其中，EcSCs的迁移和侵袭能力最强（迁移能力:P＜0.01;侵袭能力:EuSCs vs CSCsP＜0.05，EcSCs vs CSCs P＜0.01）。
　　2.大黄素对ESCs增殖、迁移和侵袭能力的影响:大黄素对EuSCs和EcSCs增殖能力的抑制呈时间和浓度依赖性(P＜0.05)。大黄素作用于EcSCs，细胞体积变小，由长梭形变成较规则的多边形;此外，大黄素能够明显降低EcSCs的迁移和侵袭能力（迁移能力:20μM P＞0.05，40μM P＜0.01;侵袭能力:20μMP＜0.05，40μM P＜0.01）。
　　3.大黄素作用于EcSCs后细胞内ILK及MET相关蛋白的表达变化:浓度梯度大黄素作用于EcSCs48h，随大黄素浓度的增加细胞中ILK、间质表型N-cadherin和vimentin的表达水平明显降低(P＜0.05)，而上皮表型E-cadherin和keratin表达明显升高(P＜0.05)。40μM大黄素作用于EcSCs，随大黄素作用时间的增加细胞中ILK、间质表型N-cadherin和vimentin的表达水平明显降低(P＜0.05)，而上皮表型E-cadherin和keratin表达明显升高（P＜0.05）。
　　结论:
　　1.大黄素能够以时间及浓度依赖性抑制子宫内膜间质细胞的增殖、迁移和侵袭能力。
　　2.大黄素能够诱导子宫内膜间质细胞发生MET抑制细胞发生迁移和侵袭。
　　3.大黄素通过调控ILK通路诱导子宫内膜间质细胞发生MET进而抑制细胞的迁移和侵袭能力。

目录

声明

摘要

符号说明

研究背景

第一部分 Periosin调控ILK通路促进子宫内膜间质细胞发生迁移、侵袭的作用及机制研究

前言

材料与方法

实验结果

讨论

结论

附图

参考文献

第二部分 Periosin调控ILK通路诱导子宫内膜腺上皮细胞发生上皮间质转化的作用及机制研究

前言

材料与方法

实验结果

讨论

结论

附图

参考文献

第三部分 大黄素调控ILK通路诱导子宫内膜间质细胞发生间质上皮转化在抑制细胞迁移和侵袭能力中的作用及机制研究

前言

材料与方法

实验结果

讨论

结论

附图

参考文献

致谢

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