CRISPR/Cas9介导的丹参基因组编辑与丹参酮合成路径的研究

摘要

中药丹参来源于唇形科多年生的草本药用植物丹参Salvia miltiorrhizaBunge的干燥根和根茎。广泛分布于中国各地，种质资源丰富。丹参药用历史悠久，始载于《神农本草经》，具有祛瘀止痛、通经活血、清心除烦的功效，被用于治疗心绞痛、月经不调、痛经、瘀血腹痛等疾病。近年来研究发现其在保护心肌、扩张血管、抗动脉粥样硬化、抗血栓、保肝及抗菌消炎方面有明显疗效。丹参中主要有效成分是脂溶性的丹参酮类和水溶性酚酸类化合物，包括丹参酮I、丹参酮IIA、丹参酮IIB、隐丹参酮、丹参素、丹酚酸等。丹参酮类化合物是二萜醌结构，是类异戊二烯代谢途径产生的，前体物质是牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸（Geranylgeranyldiphosphate,GGPP），但其下游合成通路的很多基因的功能尚不清楚。因此，如何挖掘这些基因的功能非常重要。
　　近年来，一种有效的基因敲除工具CRISPR（clustered regulatory interspaced short palindromic repeats）/Cas9（CRISPR associated protein9）的出现，为基因功能研究提供了很大助力。它可以利用一小段RNA作为引导，特异性识别靶向序列，再用核酸内切酶Cas9对靶向序列进行酶切，破坏其DNA结构。针对不同的基因序列，只需要改变引导RNA的序列就可以成功实现基因编辑。相比于ZFNs和TALEN，CRISPR/Cas9构建简单，打靶特异性高。可以预见到CRISPR/Cas9介导的基因组编辑将在未来继续加快功能基因组学的研究步伐。本实验利用CRISPR/Cas9方法敲除丹参酮合成途径的关键基因，获得了丹参酮缺陷型丹参游离毛状根突变体，通过研究突变体的次生代谢变化，进而阐释基因功能。
　　为了获得丹参游离毛状根突变体，在丹参基因组序列上设计了相应的CRISPR/Cas9敲除靶点。被靶向的基因如下：SmCPS1、SmCPS2、SmCPS4、SmP1D10、SmCYP76AH1、SmCYP76AH3、SmCYP76AK1、SmCYP76AK3、Sm3383、Sm4361。利用变性银染聚丙烯酰胺凝胶电泳的方法检测靶向序列DNA条带，初步鉴定游离毛状根突变体。通过直接测序和TA克隆后测序，鉴定了毛状根突变体的基因型。已经成功地获得了SmCPS1和SmCYP76AH1的丹参毛状根突变体株系，发现SmCPS1突变体的根表皮颜色与野生型相比发生了变化。为了提高CRISPR/Cas9的打靶效率，对所用CRISPR/Cas9载体做了丹参密码子优化的尝试。
　　采用UPLC-ESI-qTOF-MS检测丹参游离毛状根突变体的代谢产物变化，通过与野生型丹参毛状根的代谢产物的EIC和TIC图谱对比，发现在SmCPS1的纯合毛状根突变体内完全检测不到三种主要丹参酮类化合物（丹参酮Ⅰ、丹参酮ⅡA和隐丹参酮）的含量，而嵌合突变体中这三种主要丹参酮类化合物的含量均有大幅度的下降，再次证明了SmCPS1是丹参酮合成通路中的关键基因。
　　本研究建立了CRISPR/Cas9-突变体-代谢分析-基因功能阐释的方法体系，即利用CRISPR/Cas9这一基因编辑工具，特异性靶向参与丹参酮次生代谢合成途径的基因，利用代谢分析检测突变体内次生代谢产物含量的变化，进而阐释相关基因的功能。这一方法的建立为今后丹参大规模的功能性基因研究铺平了道路。

目录

声明

英文缩写词对照表

前言

第一章 利用CRISPR/Cas9技术获得丹参游离毛状根突变体

1 材料与方法

2 结果与讨论

3 小结

第二章 丹参游离毛状根突变体的次生代谢分析与基因功能阐释

1 引言

2 材料和方法

3 结果与讨论

4 小结

全文总结与工作展望

1 本文工作总结

2 今后工作的展望

致谢

参考文献

综述

1 丹参研究概况

2 CRISPR/Cas9综述

参考文献

附录Ⅰ博士研究生期间发表的论文情况

附录Ⅱ引物序列

附录Ⅲ基因序列

附录Ⅳ 优化的Cas9基因序列和丹参U6启动子