外源性CCK-8对甲基苯丙胺诱导小鼠记忆及海马神经元损伤的影响

摘要

目的:甲基苯丙胺（methamphetamine，MA）又称去氧麻黄素（碱），俗称“冰毒”，是一种具有精神活性的新型合成毒品，是属于苯丙胺类的中枢兴奋剂。苯丙胺类兴奋剂有着强烈的精神依赖作用，可以直接对中枢神经系统产生强烈的兴奋亦或抑制作用，长期使用MA可引起机体内神经元产生异常代偿性适应，引起中枢神经系统神经病理、神经化学以及行为学等的改变，使学习、记忆、运动等功能受损并产生依赖。目前研究表明，人类长期使用MA可以导致神经系统的严重损伤，认知功能的下降，注意力及记忆力减退，以及执行功能障碍等。MA的神经毒性相当明显，因此，积极探索保护因MA滥用而导致的神经损害的药物十分迫切和必要。
　　八肽胆囊收缩素(cholecystokinin octopeptide，CCK-8)作为一种神经递质和（或）神经调质参与了机体内多种生理功能的调节，比如对摄食、焦虑、认知以及学习记忆等的调节。本室既往研究发现，外源性CCK-8可以缓解吗啡引起的躯体依赖和精神依赖;侧脑室给予CCK-8(0.01、0.1、1μg)可明显改善吗啡依赖小鼠空间参考记忆的损害;经侧脑室注射外源性CCK-8可以抑制MA诱导的行为敏化的形成及表达，可明显改善MA诱导的多巴胺能神经毒性。那么CCK-8是否能够对甲基苯丙胺所诱导的学习记忆损害及对小鼠海马神经细胞损伤产生影响，尚未见报道。
　　本实验通过Morris水迷宫及H-E染色、硫堇染色、免疫组织化学等方法，分别观察外源性CCK-8对甲基苯丙胺诱导的空间参考记忆损害的影响以及小鼠海马神经细胞损伤的影响，旨在为CCK-8在新型毒品戒毒方面的应用提供相关的实验依据。
　　方法:
　　1本实验采用健康成年雄性CD-1小鼠60只，体重20-25g，随机分为生理盐水对照组、MA1 mg·kg-1组、MA2 mg·kg-1组、CCK0.1μg+MA1 mg·kg-1组、CCK0.1μg+MA2 mg·kg-1组。MA组小鼠每天（8:00 am）给予不同剂量的MA腹腔注射（1 mg·kg-1，2 mg·kg-1ip），注射MA前15min经侧脑室注射生理盐水，量等同CCK-8; CCK+MA组小鼠每天(8:00 am)在腹腔注射MA前15min经侧脑室注射CCK-8(0.1μg，icv);生理盐水对照组每天(8:00 am)腹腔注射等同MA量的生理盐水，注射前15min同样经侧脑室注射等同CCK-8量的生理盐水。Morris水迷宫实验，第1天各组小鼠不给药，行适应性训练前测，目的在于观察各组小鼠游泳速度有无差异，剔除不符合实验条件的小鼠;第2-6天为训练阶段，按上述方法给药后3小时行水迷宫训练;第7天为测试阶段，同样按上述方法给药后3小时行水迷宫测试即空间探索实验。通过水迷宫实验，以观测MA单独作用对小鼠空间参考记忆的影响以及外源性CCK-8对MA诱导空间参考记忆损害的作用。
　　2 Morris水迷宫实验测试结束后，继续按照上述方法给各组小鼠注射药物，持续至2周。模型建立后，脑组织按照脑立体定位图谱标准部位切取后常规经固定、包埋、切片，经H-E和硫堇染色、免疫组织化学染色（NeuN染色）观察小鼠海马神经元的变化，通过计数阳性细胞经统计分析，观察MA对小鼠海马神经元的影响以及外源性CCK-8对MA诱导小鼠海马神经元损伤的影响。
　　所得结果用均数±标准差（mean±SD）表示，采用SPSS16.0统计分析软件进行统计学分析，各组数据行单因素方差分析(one-wayANOVA)，组间比较用Bonferroni进行检验，以P＜0.05为有统计学差异。
　　结果:
　　1本实验共有46只CD-1小鼠用于最终的统计学分析。
　　2外源性CCK-8对MA诱导小鼠空间参考记忆损伤的影响
　　2.1 MA（1 mg·kg-1，2 mg·kg-1）明显损害了小鼠的空间参考记忆，表现为在测试时动物在目标象限（原平台所在象限）的时间和路程百分比明显减少。
　　2.2 CCK-8（0.1μg）明显改善了MA（1 mg·kg-1，2 mg·kg-1）诱导小鼠空间参考记忆的损害，表现为与MA组小鼠相比，给予CCK-8后动物在目标象限（原平台所在象限）的时间和路程百分比明显提高。
　　3外源性CCK-8对MA诱导小鼠海马神经元损伤的影响
　　3.1 H-E染色结果显示:生理盐水对照组小鼠海马各区神经元呈圆形、椭圆形或者锥形，核浆比值大，细胞核为圆形或椭圆形，着色均匀，为浅蓝紫色，核仁明显。与生理盐水对照组相比较，MA1 mg·kg-1组小鼠海马CA3区细胞组织结构未见明显异常，细胞排列稍紊乱，部分细胞固缩，胞浆胞核界线不清;MA2 mg·kg-1组小鼠海马CA3区细胞组织结构未见明显异常，细胞排列紊乱，大量神经元胞浆红染、胞核固缩，胞浆胞核界线不清。CCK0.1μg+MA1 mg·kg-1组小鼠海马CA3区细胞与MA1mg·kg-1组相比组织结构未见明显异常，偶见胞浆红染，胞浆胞核界线稍清晰。CCK0.1μg+MA2mg·kg-1组小鼠海马CA3区细胞与MA2 mg·kg-1组相比组织结构未见明显异常，细胞排列稍整齐，少量细胞固缩，胞浆胞核界线稍清晰。
　　3.2硫堇染色结果显示:生理盐水对照组细胞排列整齐，尼氏体清晰可见。与生理盐水对照组相比较，MA1 mg·kg-1组小鼠海马CA3区可见神经元排列稍紊乱，神经元蓝染，部分细胞固缩，尼氏体消失。MA2 mg·kg-1组小鼠海马CA3区可见神经元排列紊乱，神经元蓝染，多量细胞固缩，尼氏体消失。CCK0.1μg+MA1 mg·kg1组小鼠海马CA3区细胞与MA1mg·kg-1组相比细胞排列较整齐，仅见少量细胞固缩，尼氏体清晰可见。CCK0.1μg+MA2 mg·kg-1组小鼠海马CA3区细胞与MA2 mg·kg-1组相比细胞排列较整齐，仅见少量细胞固缩，尼氏体清晰可见。
　　3.3免疫组织化学染色(NeuN染色)结果显示:与生理盐水对照组相比较，MA组(1 mg·kg-1，2 mg·kg-1)小鼠海马CA3区阳性细胞数目减少且随MA浓度的增加阳性细胞数目减少的程度愈加明显;CCK+MA组小鼠海马CA3区细胞与MA组相比阳性细胞数目明显增加。
　　结论:
　　甲基苯丙胺明显损害了小鼠的空间参考记忆，对与学习记忆相关的海马神经元有损伤作用;外源性CCK-8可改善甲基苯丙胺诱导的空间参考记忆的损害，对海马神经元有保护作用。
　　注本研究得到以下基金资助
　　1河北省自然科学基金(H2014206251) CCK-8对甲基苯丙胺神经毒性的保护作用及其抗炎机制研究（5万元）2014-2016
　　2河北省高等学校创新团队领军人才培育计划(LJRC005)（60万）2014-2016

目录

声明

摘要

英文缩写

前言

材料与方法

结果

附图

附表

讨论

结论

参考文献

综述 甲基苯丙胺神经毒性机制及滥用防治的研究进展

致谢

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