PKC拮抗剂在TNF-α诱导人脐静脉内皮细胞凋亡和氧化应激中的机制研究

摘要

研究背景:
　　 近年发现血管内皮是一个十分活跃的内分泌器官，它能感受生理刺激，同时做出调节性反应，具有多种重要的生物活性。其通过分泌一系列血管活性物质调节血管张力，细胞增殖、粘附以及影响凝血纤溶系统，以维持血管内环境的平衡。血管内皮也是多种心血管疾病危险因子作用的重要靶器官。许多心血管疾病及危险因素均可导致内皮功能损伤，而内皮功能损伤又常伴发和加重心血管疾病，两者之间有着密切的联系。因此保护内皮的完整性和内皮的功能已成为治疗心血管疾病的重要目标之一。
　　 肿瘤坏死因子α(Tumor necrosis factor-α，TNF-α)作为一种具有多种生物学效应的细胞因子和重要的炎症介导因子，其与心血管疾病关系的研究成为目前的热点之一。研究发现心肌缺血再灌注损伤和慢性心衰、感染、内毒血症等各种疾病和病理状态都将会直接或间接导致体内TNF-α升高。许多以血管内皮损伤为关键发病环节的疾病，均可观察到此因子的升高。TNF-α介导的一系列信号通路将会启动和加速动脉硬化、血栓形成、血管重塑以及内皮凋亡通路的激活。TNF-α可直接作用于内皮细胞表面的TNF受体产生直接的细胞毒作用，还可通过氧化应激，影响脂代谢等方式损害内皮细胞结构，使其功能紊乱，甚至凋亡。
　　 氧化应激是机体氧化和抗氧化的失衡，其中间产物活性氧族(Reactive oxygenspecies，ROS)分为以超氧化物阴离子为代表的游离自由基和过氧化氢为代表的非游离自由基。研究表明超氧化物阴离子和过氧化物对动脉粥样硬化进展起了极大的推动作用。NADPH氧化酶由两个胞膜亚基p22phox和gp91phox/NOX2组成的细胞色素b558和胞浆亚基p47phox，p67phox，p40phox以及小GTP结合蛋白组成。在吞噬型细胞内，当胞浆亚基p47phox和p67phox发生从浆到膜的磷酸化及转位时，NADPH氧化酶便发生激活。尽管NADPH氧化酶是激活内皮细胞氧化还原反应的重要酶体，但对此酶在内皮细胞中的具体激活机制以及氧化产物的产生情况还了解甚少。
　　 相关研究表明，蛋白激酶C(Protein kinase C，PKC)是由同工酶组成的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶家族，它可能介导了内皮细胞NADPH氧化酶的激活。根据结构和激活机制，PKC家族分为3种类型：第一种为依赖磷脂酰丝氨酸-二酰甘油-Ca2+的典型PKC(conventional PKC，cPKC)，包括α、βⅠ、βⅡ、γ亚型；第二种为不依赖Ca2+的新型PKC(novel PKC，nPKC)，包括δ、ε、μ、θ、η亚型；第三种即不依赖二酰甘油和Ca2+的非典型PKC(atypical PKC，aPKC)，包括λ、ζ亚型。不同组织的PKC亚型分布不同。以内皮细胞为例，除PKCα、δ、ζ外，内皮细胞还表达PKCβ、ε、θ、η等亚型。

目录

文摘

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论文说明：英文缩略词表

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前言

第1章建立TNF-α诱导人脐静脉内皮细胞凋亡模型

1.1研究内容

1.2实验材料与方法

1.2.1主要试剂及溶液配制

1.2.2仪器设备

1.2.3实验方法

1.2.4统计学方法

1.3实验结果

1.3.1 HUVEC的原代培养

1.3.2台盼蓝染色计数检测TNF-α对内皮细胞增殖的影响

1.3.3 Tunel法定性检测凋亡细胞

1.3.4 Hoechst33342染色检测凋亡细胞

1.3.5流式细胞术Annexin V-FITC/PI双染色法定量检测细胞凋亡率

1.4本章小结

第2章PKC通路抑制剂对TNF-α诱导人脐静脉内皮细胞凋亡及氧化应激损伤的抑制作用

2.1研究内容

2.2实验材料与方法

2.2.1主要试剂及溶液配制

2.2.2仪器设备

2.2.3实验方法

2.2.4统计学方法

2.3实验结果

2.3.1不同PKC通路抑制剂对TNF-α诱导HUVEC凋亡的抑制作用

2.3.2 ROS生成

2.4本章小结

第3章PKC通路抑制剂抗凋亡和氧化应激的分子机制

3.1研究内容

3.2实验材料与方法

3.2.1主要试剂及溶液配制

3.1.2仪器设备

3.1.3实验方法

3.1.4统计学方法

3.3实验结果

3.2.1 Real-time PCR法检测基因表达

3.2.2 Western blot检测蛋白表达

3.4本章小结

讨论

参考文献

附图

志谢