甲壳素酶产生菌的筛选及酶法制备甲壳低聚糖的研究

摘要

天然存在的甲壳素结构致密、结晶度高，化学性质稳定，不溶于水、稀碱和稀酸及大部分有机溶剂，很难被水解。本文旨在利用蒸汽爆破、高压均质、辐照等物理方法处理甲壳素，破坏其结晶结构；并从自然界筛选甲壳素酶产生菌，利用其甲壳素酶水解甲壳素制备甲壳低聚糖，尝试解决目前生产甲壳低聚糖过程中污染严重等问题。本论文的主要研究结果如下：
　　（1）从土壤中分离得到一株产甲壳素酶的细菌，经形态学、生理生化及分子生物学鉴定，确定为多粘类芽孢杆菌（Paenibacillus polymyxa)，命名为A1。通过发酵条件优化，确定了菌株A1发酵产甲壳素酶条件如下：培养基采用1％甲壳素（120目），0.05%MgSO4·7H2O，1.2%尿素，0.5%NaCl，0.07% K2HPO4，0.03%KH2PO4，0.3%酵母提取粉，初始pH4.5，接种龄12 h，接种量1%，于37℃培养78 h，在此条件下，该菌产甲壳素酶水平达到0.549 U/mL。
　　（2）多粘类芽孢杆菌A1发酵上清液经硫酸铵分级沉淀、透析、冷冻干燥后制得甲壳素酶粗酶，经DEAE-52离子交换柱层析、Sephadex G-75凝胶过滤柱层析分离纯化，制得电泳纯的甲壳素酶，纯化倍数为4.3，回收率为18.4%。
　　（3）对上述纯化的甲壳素酶进行酶学性质研究，确定其相对分子质量约为30.0 kDa，最适反应温度为50℃，温度低于45℃时，酶的热稳定性较好。该酶最适反应pH值为4.5，但是在pH4.0-5.0之间稳定性较好。SDS、维生素C和H2O2对该酶有抑制作用，N-乙酰氨基葡萄糖、氨基葡萄糖和葡萄糖对该酶有一定的激活作用；Ca2+，Fe2+,Fe3+，Ni2+对该酶有激活作用，Cu2+对该酶有抑制作用。在以胶体甲壳素为底物的最适条件下，该酶的米氏常数Km为4.28 mg/mL。该酶可水解羧甲基甲壳素，在水解的最初阶段，溶液的粘度迅速下降，表明该酶属于内切酶。
　　（4）比较了蒸汽爆破、高压均质和辐照三种处理方法对甲壳素结构的破坏效果。扫描电镜观察发现，经蒸汽爆破和高压均质处理后的甲壳素的结构出现了许多小孔或凹槽，结构也变得比较疏松，辐照处理后的甲壳素的结构无变化；X射线衍射结果显示蒸汽爆破三次处理后的甲壳素的结晶指数CrI110和CrI020分别下降了23.2%和24.7%，高压均质三次处理后的甲壳素的结晶指数CrI110和CrI020分别下降了12.4%和28.7%，辐照处理后的甲壳素无变化。这些结果表明，蒸汽爆破和高压均质预处理能够降低甲壳素的结晶度。通过红外光谱还发现经蒸汽爆破和高压均质处理后的甲壳素的脱乙酰度有所提高，蒸汽爆破三次和高压均质三次处理后的甲壳素的脱乙酰度由20.3%分别提高到33.5%和26.0%，辐照处理后的甲壳素无变化。
　　（5）用非专一性酶水解无定型甲壳素发现木瓜蛋白酶水解效果最高，但木瓜蛋白酶对未处理的甲壳素以及经过蒸汽爆破和高压均质处理后的甲壳素均不能水解。灰色链霉菌外切甲壳素酶能够水解未处理的甲壳素、蒸汽爆破处理的甲壳素和高压均质处理的甲壳素，水解液中还原糖浓度分别为0.251 mg/mL、0.145 mg/mL和0.407 mg/mL。用多粘类芽孢杆菌A1甲壳素酶分别水解未处理的甲壳素以及经过蒸汽爆破、高压均质和辐照处理的甲壳素，发现蒸汽爆破三次处理组和高压均质二次处理组的还原糖浓度比对照组分别提高了40%和300%左右，而辐照处理组与未处理组则没有差别。说明蒸汽爆破和高压均质预处理可以提高甲壳素酶对甲壳素的作用效率。
　　（6）GPC、HPLC和质谱分析结果表明，多粘类芽孢杆菌A1甲壳素酶水解胶体甲壳素的产物为N-乙酰胺葡萄糖和甲壳二糖。

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1 前言

1.1 甲壳素

1.2 甲壳低聚糖

1.3 甲壳低聚糖的制备方法

1.4 甲壳素酶的研究概况

1.3 本论文的立题依据与研究内容

2 材料与方法

2.1 材料

2.2 主要试剂

2.3 仪器设备

2.4 实验方法

3 结果与分析

3.1 产甲壳素酶菌株的筛选及鉴定

3.2 产甲壳素酶菌株A1发酵条件研究

3.3 甲壳素酶的分离纯化

3.4 甲壳素酶酶学性质研究

3.5 不同处理方法对甲壳素微观结构的影响

3.6 酶水解甲壳素的研究

3.7 水解产物的分析

4 讨论与结论

4.1 讨论

4.2 结论

4.3 创新点

4.4 存在的问题与展望

致谢

参考文献

附录 作者攻读硕士学位期间获奖和发表论文情况