甲壳素脱乙酰酶产生菌的筛选、cDNA克隆及原核表达研究

摘要

论文内容主要分为三个部分，第一部分侧重于甲壳素脱乙酰酶(CDA)产生菌的筛选。 本文比较了几种霉菌：总状毛霉(Mucor racemosus)、青霉(Penicillium sp.)、曲霉(Aspergillus sp.)、根霉(Rhizopus sp.)菌株在对数生长末期和稳定期末期的细胞内和细胞外CDA的酶活性。结果显示：(1)各霉菌的胞内和胞外都具有CDA活力，而且胞外的酶活力均大于胞内的酶活力；(2)处于对数生长期末期的总状毛霉菌株的CDA活力最高，其胞外酶活力达到97.2±4.2 U·(g干菌丝体)<'-1>，发酵菌株产酶总活力为83.1±3.6 U，均显著高于其他菌株(P<0.5)。酶学特性研究表明：该酶的最适温度为50℃，最适pH在7.2左右，低温保存(4℃)稳定性较差，每24小时酶活力下降30％以上。 第二部分着重从总状毛霉中克隆CDA基因，并对其序列进行分析。 从处于对数生长期的总状毛霉菌丝体中抽提得到总RNA，用已知真菌CDA保守区设计简并引物，进行PT-PCR扩增，结合RACE技术，分离和克隆到了2个总状毛霉CDA的全长cDNA，并进行了全序列测定，提交GenBank，CDAl和CDA2的cDNA序列登录号分别为DQ538514、DQ678929。再根据已知的cDNA序列设计基因特异性引物，以总状毛霉全基因组DNA为模板，扩增得到了2个CDA基因的DNA片段，克隆并测序。CDA1和CDA2的DNA序列在Genbank的登录号为EF468348、EF468349。利用生物信息学的方法，对总状毛霉的CDA1和CDA2的DNA及cDNA序列进行分析和酶蛋白构象预测，结果如下： (1)CDA1基因(cDNA)全长为1506 bp，包括下列三部分：5’非翻译区(67 bp)；阅读框(1344 bp)，共编码448个氨基酸残基； 3’非翻译区(95bp)，其中包含加尾信号AATAAA及Poly(A)。在该基因的DNA分子内部(876～937bp)有一个内含子，长度为62bp，此内含子的5’和3’剪接位点符合GU—AG规则。 而CDA2基因(cDNA)全长为1378 bp，分别为：5’非翻译区(23 bp)；1254bp阅读框，编码418个氨基酸残基；101bp 3’非翻译区，其中包含了加尾信号AATAAA及Poly(A)。该基因的DNA分子中不含有内含子序列。 (2)通过同源性搜索(Blastp)可知：CDA1和CDA2的cDNA中间部分均包含一由144个氨基酸残基组成的多糖脱乙酰酶保守结构域，约占总状毛霉CDA全长的30％。该保守结构域不仅存在于毛霉属(Mucoraceae)微生物的CDA中，而且在其他真菌(如Saccharomyces cerevisiae)中存在，甚至在一些细菌(如Bacillus subtilis)的多糖脱乙(3)CDA1基因与其它相近种米根霉(Rhizopus oryzae)、卷柄根霉(Rhizopus circinans)的CDA1和CDA2、鲁氏毛霉(Mucor rouxii)、卵形孢球托霉(Gongronella butleri)、匍枝根霉(Rhizopus stolonifer)、布拉克须霉(Phycomyces blakesleeanus)、酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)的CDA1和CDA2基因的序列同源性分别为：75％、58％、56％、56％、48％、39％、39％、17％和16％；相应的氨基酸序列的同源性分别为：69％、57％、59％、55％、47％、30％、32％、18％和21％。CDA2基因与该霉的CDA1基因、其它相近种米根霉、卷柄根霉的CDA1和CDA2、鲁氏毛霉、卵形孢球托霉、匍枝根霉、布拉克须霉、酿酒酵母的CDA1和CDA2基因的序列同源性分别为：55％、51％、55％、53％、68％、43％、35％、15％、 14％和H13％；相应的氨基酸序列的同源性分别为：52％、52％、54％、49％、66％、47％、33％、32％、23％和24％。所以，真菌的CDA基因在进化上并不保守。 (4)根据CDA基因推测所得氨基酸序列构建的不同真菌的系统树，与采用经典分类法构建的系统树基本一致。 (5)通过同源建模方法，预测了CDA1和CDA2基因所编码的蛋白质的三级结构，验证了蛋白质具有CDA完整的功能性结构，并包含多糖脱乙酰酶结构域，两者具有相似的空间结构。 (6)信号肽预测分析表明：CDA1和CDA2推测蛋白质的N-末端均存在信号肽，信号肽长度分别为22和24个氨基酸残基。 第三部分的主要内容为将总状毛霉CDA1和CDA2基因进行原核表达，并对重组蛋白纯化、分析。 运用基因重组的方法手段，将CDA1和CDA2基因构建进入原核表达质粒pET28a、pET22b、pET32a及pET43.1a，经过PCR鉴定、双酶切鉴定以及表达区域全部或部分序列测定，结果证实：已正确构建了pET28a-CDA1、pET28a-CDA2、pET32a-CDA1、pET32a-CDA2、pET43.1a-CDA1、pET43.1a-CDA2、pET22b-CDA1及pET22b-CDA2共8个重组质粒。其中pET28a-CDA1、pET28a-CDA2的全序列测定表明：重组区域的CDA1基因(共1278bp)有4个碱基发生突变，两个造成了氨基酸突变；而重组质粒的CDA2基因(共1182bp)中也有2处碱基发生突变，其中之一的氨基酸序列也发生了突变，两基因片段突变率均小于0.5％；在其余6个重组质粒的表达基因接入区域，部分序列测定的结果显示：CDA1和CDA2的基因(无内含子)均已去除信号肽，并正确的接入了表达区域，未产生移码突变。 将8个重组质粒转化进入宿主菌大肠杆菌BL21(DE3)，采用37℃、终浓度为0.5～lmmol/L的IPTG诱导重组蛋白表达。结果表明：重组质粒在宿主细胞内都成功地表达产生了蛋白质，所得的重组蛋白或融合蛋白的分子量与预计的理论值相符。重组质粒pET28a-CDA1、pET28a-CDA2、pET22b-CDA1及pET22b-CDA2表达的重组蛋白以包含体为主；而pET32a-CDA1、pET32a-CDA2、pET43.1a-CDA1及pET43.1a-CDA2表达的融合蛋白仍以包含体为主，但已能电泳检测到一定比例的司溶表达部分。利用亲和层析可以分离、纯化重组质粒pET28a-CDA1、DET28a-CDA2表达的包含体蛋白质。从诱导后表达的细胞中离心分离出包含体形式的重组蛋白，用6M盐酸胍变性溶解后，专一性的结合在HisTrap(Ni<'2+>-Sepharose)亲和柱，用6-0M脲线性梯度、使变性的重组蛋白在柱上重折叠，最后改变咪唑浓度(10-500mM)、梯度洗脱亲和柱上结合的重组蛋白，得到了单一的洗脱峰，该洗脱峰组分经SDS-PAGE鉴定为电泳纯，分子量与CDA1和CDA2重组蛋白一致。将亲和层析洗脱得到的重组蛋白组分进行脱盐除去咪唑，防止对酶活性测定造成干扰，结果表明：经过亲和层析、凝胶过滤层析所得的CDA1和CDA2重组蛋白溶液，均具有一定的甲壳素脱乙酰酶活性，酶的比活力分别为0.01U/mg和0.05U/mg。

目录

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声明

甲壳素脱乙酰酶的研究进展

第一章产甲壳素脱乙酰酶霉菌菌株的筛选及酶学性质

1材料

2方法

3结果

3.1各菌种的生长曲线

3.2霉菌产甲壳素脱乙酰酶能力比较

3.3毛霉胞外甲壳素脱乙酰酶的特性

4小结与讨论

第二章总状毛霉(Mucor racemosus)甲壳素脱乙酰酶全长cDNA的克隆

1材料

2方法

3结果

3.1总RNA的抽提结果

3.2总状毛霉甲壳素脱乙酰酶全长cDNA的克隆

3.3序列拼接与分析

3.4总状毛霉基因组DNA提取及CDA基因的扩增

3.5总状毛霉CDA基因的DNA序列分析

4小结及讨论

第三章甲壳素脱乙酰酶的核苷酸序列分析和蛋白结构预测

1材料和方法

2结果和分析

2.1核苷酸及推测氨基酸序列分析

2.2三维结构预测

2.3系统发生分析

2.4信号肽预测

3结论

第四章总状毛霉甲壳素脱乙酰酶基因的原核表达研究

1材料

2方法

3结果及分析

3.1重组质粒的双酶切鉴定

3.2重组质粒的测序鉴定

3.3重组质粒在大肠杆菌中的表达

4小结及讨论

第五章甲壳素脱乙酰酶重组蛋白的纯化及活性测定

1材料

2方法

3结果

3.1重组蛋白的分离纯化

3.2重组蛋白的SDS-PAGE分析

3.3重组蛋白的酶活鉴定

4小结和讨论

5研究展望

参考文献

致谢