伪狂犬病病毒IE180基因的克隆、原核表达及其对减毒沙门氏菌为载体的口服DNA疫苗免疫效力研究

摘要

本研究以猪伪狂犬病病毒（PRV）Fa毒株为材料，通过聚合酶链式反应（PCR）方法将IE180基因分为两段扩增，并将其定向连接至pMD18-TSimple克隆载体。对所获得的目的基因进行原核表达载体构建、原核表达，真核表达载体构建及其以减毒沙门氏菌为载体的口服DNA疫苗的免疫效力的研究。主要研究内容如下： 1．正180基因的分段克隆 参照GenBank中登录号为AF352564的PRV TNL株的IE180基因序列，利用正180基因中自带的且唯一的NcoⅠ酶切位点，在此位点前后设计两对特异性引物。以本实验室保存的PRV Fa株为材料，扩增出前后两个片段后分别连至pMD18-T Simple载体，命名为pMD-Ⅰ和pMD-Ⅱ。对载体进行双酶切，回收pMD-Ⅰ质粒的1．8kb片段（IE180基因的前半段）和pMD-Ⅱ质粒的5．2kb片段（连接有IE180基因后半段的pMD18-T Simple载体）。对回收的目的条带进行连接，得到连接于pMD18-T Simple载体的IE180全基因，命名为pMD-IE180。通过酶切鉴定及序列测定，证实成功克隆出IE180基因。序列测定显示，克隆出4389bp的ORF，G+C含量为79．9％，编码1462个氨基酸，推算出的分子量是150，117Da。 2．IE180基因原核表达载体构建、原核表达及IE180蛋白活性检测 采用EcoRⅠ、SalⅠ对之前得到的pMD-IE180基因克隆载体进行双酶切，回收4．4kb大小IE180基因片段，然后利用原核表达载体pET-32a（+）中的多克隆酶切位点，将目的片段定向插入其中，构建了原核表达载体pET-IE180。阳性重组质粒转化大肠杆菌Rosetta（DE3），IPTG诱导融合表达。经SDS-PAGE检测，重组菌诱导后样品在200 kD左右有明显的融合蛋白条带，但蛋白表达量较小。试验确定IE180蛋白表达的最佳条件为IPTG0．2mmol/L，37℃诱导培养4h，表达出的IE180蛋白主要以包涵体的形式存在。使用Western Blot方法对纯化复性后的包涵体进行检测，证实其具有免疫活性。 3．IE180基因真核表达载体的构建及其以减毒沙门氏菌为运送载体的口服DNA疫苗免疫效力研究 从克隆质粒pMD-IE180中酶切出IE180基因，并与酶切回收的真核表达载体pCI-neo定向连接，构建出真核表达质粒pCI-IE180，并将其电转化入减毒猪霍乱沙门氏菌S．C500。将30只小鼠随机分成3组，每组10只，分别是空白对照，S．C500/pCI-neo空质粒组，S．CS00/pCI-IE180重组质粒组。每2周进行一次灌胃免疫，共4次。对照组小鼠每次灌胃10％碳酸氢钠0．2mL，其余两组用分别用10％碳酸氢钠重悬细菌至109个/0．2mL后灌胃0．2mL。首免后第2、4、6、8周采血分离血清，间接ELISA方法检测抗体水平。末次采血后小鼠腹腔注射0．1mL102．3倍稀释的PRV（5倍LD50）。ELIASA结果显示，以减毒沙门氏菌为运送载体的pCI-IE180口服DNA疫苗具有一定的免疫原性，可以刺激小鼠机体产生一定水平的抗体（1：1600）。攻毒保护实验证实本疫苗对小鼠有一定的保护力，可以在5倍L，D50 PRV攻毒，致使对照组全死的情况下保护约30％的小鼠存活。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：缩略词表

声明

第一章 文献综述

1 研究进展

1.1 伪狂犬病及其病毒简介

1.2 IE180基因及IE180蛋白功能的研究进展

1.3 DNA疫苗的研究进展

1.4 运送DNA疫苗的减毒沙门氏菌载体系统研究进展

2 实验目的、意义

第二章 伪狂犬病病毒IE180基因的分段克隆与序列分析

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.2 实验方法

2 结果

2.1 PCR扩增目的基因电泳鉴定

2.2 IE180基因两个片段的重组质粒酶切鉴定

2.3 IE180全基因重组克隆质粒酶切鉴定

3. 讨论

第三章 PRV IE180基因原核表达和活性检测

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.2 方法

2 结果

2.1 重组原核表达载体pET-IE180的酶切鉴定

2.2 SDS-PAGE分析IE180蛋白的表达

2.3 IE180重组蛋白的表达条件的优化

2.6 Western blot分析

3 讨论

第四章 真核表达载体构建及以减毒沙门氏菌为载体的DNA疫苗免疫效力研究

1 材料和方法

1.1 材料

1.2 方法

2 结果

2.1 真核表达载体pCI-IE180酶切鉴定

2.2 转化入减毒沙门氏菌S.C500的pCI-IE180质粒酶切鉴定

2.3 质粒遗传稳定性试验

2.4 PRV的半数致死量测定

2.5 ELISA检测特异性抗体

2.6 攻毒保护实验

3 讨论

3.1 载体的选择

3.2 免疫接种途径的选择

3.3 核酸疫苗诱导机体体液免疫反应

3.4 攻毒后的保护情况

3.5 关于质粒向减毒沙门氏菌转化

全文总结

参考文献

致谢

附录 IE180基因测序结果如下