猪伪狂犬病病毒Fa株糖蛋白gL基因分子克隆、原核表达及核酸疫苗免疫效力研究

摘要

本研究以猪伪狂犬病毒（PRV）Fa株的毒种为材料，扩增克隆gL基因，同时利用所获得的目的基因进行原核表达载体构建、表达及真核表达载体构建及免疫效力的研究，主要研究内容如下： 1、PRV gL基因的分子克隆与序列分析 参照GenBank中登录号为NC006151的PRV Fa株的gL基因序列，利用Oligo6．0和Premier软件辅助设计1对引物，以Vero细胞增殖培养的PRV为材料，采用PCR技术扩增gL基因，用TA克隆法连接到pMD18-T-vector载体上，构建克隆重组质粒pMD-gL。并将阳性菌送公司测序，序列测定显示，克隆出503bp片段，包含1个471bp的ORF框，编码127个氨基酸。将测序结果及推导的氨基酸序列与国内外的不同来源的5个毒株进行生物学信息比较分析，克隆的gL基因核苷酸序列同源性在96％～100％，氨基酸同源性在96．3％～98．8％，不同的PRV毒株间的gL基因在核苷酸水平和氨基酸水平上是高度保守的。 2、PRV gL基因原核表达载体构建及活性检测 为了去除gL基因的信号肽（gL-n），重新设计1对引物，以pMD-gL为模板，采用亚克隆技术扩增目的基因，用TA克隆法连接到pMD18-T载体上，构建克隆重组质粒pMD-gL-n，将酶切鉴定正确的阳性菌送公司测序，测序结果与模板中去掉信号肽的对应序列完全一致。 用EcoRⅠ和SalⅠ限制性内切酶切下目的基因（gL-n），再定向连接到pET32a（+）中，获得重组原核表达载体pET-gL-n。酶切鉴定正确后转化到高效表达菌株E． coli BL21（DE3）进行表达研究。经IPTG诱导，SDS-PAGE电泳检测显示，约在39KDa处出现一条特异表达带，原核重组表达载体pET-gL-n表达获得预期的融合目的蛋白，Western Blot检测显示表达的去信号肽融合蛋白具有特异的反应原性。 3、PRV gL基因核酸疫苗构建及其免疫效力的研究 从克隆质粒pMD-gL中酶切出gL基因，并与酶切回收的真核表达载体pCI-neo定向连接，构建真核表达质粒pCI-gL，并将其电转化入减毒猪霍乱沙门氏菌S．C500。将30只小鼠随机分成3组，每组10只，分别是空白对照，S．C500/pCI-neo空质粒组，S．C500/pCI-gL重组质粒组。每2周进行一次灌胃免疫，共4次。对照组小鼠每次灌胃10％碳酸氢钠0．2mL，其余两组用分别用10％碳酸氢钠重悬细菌至109个/0．2mL后灌胃0．2mL。首免后第2、4、6、8周采血分离血清，间接ELISA方法检测抗体水平。末次采血后小鼠腹腔注射0．2mL稀释的PRV（200TCID50/0．1 ml）。ELISA结果显示，以减毒沙门氏菌为运送载体的pCI-gL口服DNA疫苗具有一定的免疫原性，可以刺激小鼠机体产生一定水平的抗体。攻毒保护实验证实本疫苗对小鼠有一定的保护力，可以在200TCID50/0．1 ml攻毒后，致使对照组全死的情况下保护约70％的小鼠存活。

目录

文摘

英文文摘

声明

第一章 文献综述

1 伪狂犬病病毒研究进展

1.1 猪伪狂犬病流行特点

1.2 临床症状及病理变化

1.3 发病机理

1.4 病毒分子生物学

1.5 PRV的诊断

2 核酸疫苗研究进展

2.1 核酸疫苗发现

2.2 核酸疫苗免疫应答

2.3 核酸疫苗的构建

2.4 减毒沙门菌载体及其在疫苗研究中的应用进展

3 PRV gL基因的结构和功能

3.1 PRV gL基因的机构

3.2 PRV gL基因的功能

3.3 PRV gL基因研究的重要性

第二章PRV gL基因的分子克隆与序列分析

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.2 实验方法

2 结果

2.1 PCR扩增目的基因电泳鉴定

2.2 重组克隆质粒pMD-gL酶切鉴定

2.3 序列测定结果分析

3 讨论

第三章 PRV gL基因原核表达和活性检测

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.2 方法

2 结果

2.1 gL基因去信号肽(gL-n)的PCR扩增

2.2 重组克隆质粒pMD-gL-n的酶切鉴定

2.3 去信号肽gL基因序列测定结果

2.4 重组原核表达载体pET-gL-n的酶切鉴定

2.5 SDS-PAGE分析gL基因去信号肽的蛋白表达

2.6 Western blot分析

3 讨论

第四章PRV gL基因真核表达载体构建及免疫效力研究

1 材料和方法

1.1 材料

1.2 方法

2 结果

2.1 真核表达载体pCl-gL酶切鉴定

2.2 表达gL基因的工程菌S.C500/PCI-gL的PCR鉴定结果

2.3 ELISA检测特异性抗体

2.4 T淋巴细胞亚类数量测定

2.5 攻毒保护实验

3 讨论

3.1 载体的选择

3.2 运送载体和免疫途径的选择

3.3 核酸疫苗诱导机体体液免疫反应

3.4 T淋巴细胞水平与机体免疫状况

3.5 攻毒后的保护情况

全文总结

参考文献

致谢