体外不同动态张、压应力刺激调控人牙周膜成纤维细胞功能和结构的实验研究

摘要

牙齿受外力作用的大小对其本身及支持组织的健康至关重要，在临床修复和正畸加力过程中，恢复适当的咬合力和选择大小适宜的矫治力尤显重要。当牙齿受力时，外力通过牙周膜传递和分散至颌骨，从而引发牙周组织对外力作用的生理应答。牙周膜成纤维细胞是构成牙周膜的主体细胞，在牙周组织的改建过程中发挥极其重要的作用，研究应力对HPDLF功能和结构的影响及应力在HPDLF的信号转导途径具有重要意义。 目的：本研究采用Forcel四点弯曲加力装置，构建人牙周膜成纤维细胞体外培养一力学刺激模型，对人牙周膜成纤维细胞施加不同动态张、压应力刺激，观察机械力刺激对Ⅰ型胶原、纤连蛋白和整合素βlmRNA及蛋白表达的影响以及细胞骨架的变化。探讨人牙周膜成纤维细胞在机械力作用下的生物学行为变化，为进一步阐明牙周膜在咬合力、矫治力作用下的适应性改建机理和机械力信号在细胞内的转导机制提供理论依据。 方法：(1)采用刮取牙根中1／3牙周膜组织的取材方法，采用Ⅰ型胶原酶消化+组织块贴附法进行hPDLF原代培养，通过传代对细胞分离纯化，观察细胞形态特征，绘制生长曲线，对细胞来源做免疫细胞化学鉴定，并观察种板后细胞的生长活性，获取后续加载实验所需细胞。(2)用Forcel四点弯曲加载装置通过对体外培养的人牙周膜成纤维细胞分别施加不同动态的张、压应力，采用实时荧光定量PCR法研究机械力对人牙周膜成纤维细胞I型胶原和纤连蛋白mRNA表达的影响，用免疫细胞化学方法测定机械力对人牙周膜成纤维细胞I型胶原和纤连蛋白蛋白表达的影响。(3)用四点弯曲细胞力学加载装置对体外培养的hPDLF施加不同动态张、压应力，采用实时荧光定量PCR法研究机械力对人牙周膜成纤维细胞整合素β1亚单位mRNA表达的影响，采用Western blot法分析机械力对人牙周膜成纤维细胞整合素β1亚单位蛋白表达的影响。(4)用四点弯曲细胞力学加载装置对体外培养的hPDLF施加不同动态张、压应力，经荧光倒置显微镜观察细胞形态变化，细胞骨架荧光染色强度测定分析细胞骨架F-actin表达量的变化。 结果：(1)在较短时间内通过体外培养获得了大量活力旺盛的人牙周膜成纤维细胞，其在应力加载系统的加力板上贴壁生长情况良好，适宜作为细胞应力模型的研究对象。(2)机械力的大小、性质及加力时间都对hPDLF I型胶原和纤连蛋白mRNA和蛋白合成产生影响，但在效应强度上有区别。hPDLF I型胶原和纤连蛋白对张应力的刺激更能适应一些，压应力对细胞的损害更大。与I型胶原比较，纤连蛋白合成受机械力的调控更强一些。(3)加力后，hPDLF整合素β1亚单位mRNA和蛋白表达量下调，这种下调变化与所施加应力的性质、大小和作用持续时间相关。hPDLF整合素β1对张、压应力刺激的感应不完全一致，机械力刺激越强，整合素β1表达越明显。(4)加力后细胞骨架形态和微丝蛋白发生变化：形态梭形、排列呈漩涡状、F-actin纤维粗且分布均匀→形态不规则、沿力的方向排列整齐、F-actin纤维细且分布不均匀→加力前形态；细胞F-actin荧光染色强度正常→下降→正常；细胞骨架对张应力作用和压应力作用的反应敏感程度无明显差异。 结论：本研究在国内首次采用实时荧光定量PCR法、Western blot分析等先进的研究技术，对人牙周膜成纤维细胞施加不同动态张、压应力刺激，观察机械力刺激对I型胶原、纤连蛋白和整合素β 1mRNA及蛋白表达的影响以及细胞骨架的变化，结果表明动态张、压应力刺激可以促进目的基因mRNA和蛋白表达改变，相同的机械力对细胞的不同成分效应不同，不同的力对细胞同一成分效应也不同，机械力刺激对各基因的调控机制不同。张应力和压应力在细胞中的传导途径可能不完全一致。hPDLF细胞骨架的形态结构具有一定的稳定性，适宜的机械力刺激可以促进细胞发挥功能活性。实验目的基因可能参与机械力信号在细胞中的传导。结果提示我们在修复临床中要恢复适当的咬合接触，既要让余留天然牙得到一定的咬合力刺激又不能产生早接触、扭力、挤压力等不良应力以维持余留牙、牙根的牙周健康。

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缩略词表

前 言

第一部分人牙周膜成纤维细胞的体外培养

第二部分不同动态张、压应力调控人牙周膜成纤维细胞Ⅰ型胶原、纤连蛋白mRNA和蛋白表达的实验研究

第三部分不同动态张、压应力对人牙周膜成纤维细胞整合素β 1mRNA和蛋白表达影响的实验研究

第四部分不同动态张、压应力作用下人牙周膜成纤维细胞细胞骨架变化的实验研究

全文总结

参考文献

力学刺激在牙周膜成纤维细胞中的信号转导

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