体外不同动态力学应变对人牙周膜成纤维细胞整合素α、α、β表达和细胞增殖、功能活性的影响的初步研究

摘要

在生理状况下的咀嚼运动或是咬合创伤期、正畸治疗或是各种修复体行使功能时，不同的机械力作用于牙体并传递到牙周组织，引起包括牙周膜和牙槽骨在内的牙周组织的改建。牙周膜成纤维细胞(periodontalligamentfibroblast，PDLF)作为牙周膜中的主要感受性细胞和效应性细胞，对牙周组织的改建起着关键的调控作用，其增殖活性和功能状态的改变也直接反映了牙周组织改建的状态。因此，深入研究PDLF在机械应力作用下的生物应答及应答机制是十分必要的。 目的： 本课题旨在通过四点弯曲细胞力学加载装置对体外培养的人牙周膜成纤维细胞(humanperiodontalligamentfibroblast，HPDLF)进行加载，比较全面地探讨了HPDLF在不同作用方式、不同大小和不同作用时间的动态力学微应变范围内细胞增殖、功能活性及细胞膜表面整合素α5、α6、β1表达的变化。研究动态力学应变作用下HPDLF的生物学行为的改变，并初步探讨机械应力与整合素介导的信号转导的关系。 四川大学华西口腔医学院博士学位论文方法：1.采用刮取刚拔除的牙齿牙根中1/3部位的牙周膜组织的方法进行取材，采用Ⅰ型胶原酶消化+组织块贴附的方法培养原代细胞并传代，对细胞进行来源鉴定和碱性磷酸酶(alkalinephosogatase，ALP)染色，观察细胞的形态特征，绘制细胞生长曲线。为细胞力学加载实验准备实验细胞。 2.将体外培养的HPDLF接种在特制的细胞培养板上，采用四点弯曲细胞力学加载装置对其进行加载，频率为0.5Hz，应变幅度分别为1000、2000、4000μstrain的动态力学微应变(即分别相当于0.1、0.2、0.4％的细胞变形)，加载时间选取的是12hr内的不同时间点。通过流式细胞术(flowcytometry,FCM)分析细胞周期的改变，比较全面地探讨不同作用方式、大小和时间的动态力学应变对细胞增殖活性的影响。 3.采用四点弯曲细胞力学加载装置对体外培养的HPDLF进行加载，通过定量分析的方法，比较全面地探讨不同作用方式、大小和时间的动态力学应变对细胞总蛋白含量和ALP活性的影响。 4.采用四点弯曲细胞力学加载装置对体外培养的HPDLF进行加载，通过FCM分析不同动态力学应变对HPDLF膜表面整合素α5、α6、β1表达的影响，初步探讨机械应力与整合素介导的信号转导的关系。 结果： 1.体外培养获得了典型的、具有稳定增殖特性的HPDLF，适于对细胞进行力学加载实验。 2.本实验加载装置所产生的动态力学微应变范围对HPDLF的G0/G1期、S期细胞百分比和增殖指数PI产生明显的影响，其中G0/G1期细胞百分比的减少、S期细胞百分比和PI的增加，提示细胞从G1期向S期转化，细胞增殖活性增加；而且此影响与应变的作用方式、应变大小、-5-四川大学华西口腔医学院博士学位论文作用时司密切相关。 3.本实验加载装置所产生的动态力学微应变范围引起了HPDLF总蛋白含量及ALP活性的增高，而且此影响与应变的作用方式、应变大小、作用时间密切相关；总蛋白含量及ALP活性总蛋白含量及ALP活性的变化趋势并不完全相同。 4.本实验证明了未加力条件下体外培养的HPDLF膜表面同时有整合素α5、α6、β1亚单位的表达；而且β1的表达量最高，α5次之，α6较低。动态力学应变引起了HPDLF膜表面整合素α5、α6、β1表达的上调，此影响与应变的大小和作用时间密切相关；在不同亚单位间存在一定的相关性和差异性。 结论： 根据本实验的上述结果可以推测，动态力学应变引起的HPDLF膜表面整合素α5、α6、β1表达的变化，与细胞增殖、合成功能的变化及细胞分化密切相关。整合素表达的变化早于细胞增殖和功能活性的变化，是一个较早期的细胞应答反应，提示它们之间可能存在着一定的因果关系。在适宜大小和作用时间的动态力学应变下，随着细胞膜表面整合素α5、α6、β1表达的上调，可能通过引发一系列的信号转导通路，调节细胞的增生、分化、凋亡以及细胞因子生成等细胞的生理机能，从而表现出细胞增殖活性和合成功能的增加、促进细胞分化。当然细胞内还存在其他多种信号传导途径对细胞生理机能的调控。结果提示，整合素β1亚族可能在HPDLF的力学信号转导和细胞增殖、功能活性方面具有重要的调控作用。 根据实验的研究结果，在本实验加载装置所采用的频率为0.5Hz，应变幅度为1000、2000、4000μstrain的动态力学微应变范围内(即分别相当于0.1、0.2、0.4％的细胞变形)，适宜大小和作用时间的力学应变-6-四川大学华西口腔医学院博士学位论文既能引起体外培养的HPDLF膜表面整合素α5、α6、β1表达的上调，细胞增殖活性和合成功能增加、促进细胞分化。结果提示，在体内生理状况下的咀嚼运动和修复体正常行使功能(即非咬合创伤和正畸加力)，牙周组织受到适宜的机械性应力作用时，HPDLF作为牙周膜中的主要感受性细胞和效应性细胞，对包括牙槽骨在内的牙周组织的改建起着关键的调控作用；其增殖活性和功能状态的良性改变也直接反映了牙周组织改建的良性状态。 但应当注意的是，体外模拟HPDLF加力的实验研究由于所用的实验加载装置的不同，实验结果根据应力方式、应力大小、应力变化频率和作用时间的不同而有所差异。因此，本实验结果与其他学者的实验结果有一定的相关性，但并不具备可比性。此外，体外模拟HPDLF加力的实验研究受到一定的局限，不能完全模拟体内的受力环境；同时离体状态的细胞由于没有组织结构的制约，其生物学行为的响应与群体细胞组织化的整体行为响应具有较大的差异性。因此，在分析体外实验的结果时，不能简单地套用到体内。本实验结果仅在一定程度上从细胞水平和分子生物学角度揭示了机械力作用下牙周组织的改建过程，对临床牙周组织的保护与重建具有一定的实际意义，并为临床修复设计中合理控制牙齿受力提供了一定的实验依据和理论基础。

目录

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英文缩略词表

前言

第一部分人牙周膜成纤维细胞的原代、传代培养及实验细胞的制备

材料和方法

结果

讨论

小结

第二部分体外不同动态力学应变对人牙周膜成纤维细胞增殖活性的影响

材料和方法

结果

讨论

小结

第三部分体外不同动态力学应变对人牙周膜成纤维细胞碱性磷酸酶活性的影响

材料与方法

结果

讨论

小结

第四部分体外不同动态力学应变对人牙周膜成纤维细胞膜表面整合素α5、α6、β1表达的影响

材料与方法

结果

讨论

小结

全文总结

论文参考文献

综述

第一部分细胞力学研究手段

第二部分：PDLF的研究进展

第三部分：PDLF对机械性应力应变刺激的反应

1PDLF对机械性应力应变刺激的反应1

1PDLF对机械性应力应变刺激的反应2

2三维培养的PDLF对机械应力的反应

3力学信号在PDLF内的信号转导

3力学信号在PDLF内的信号转导3.1G蛋白及其偶联受体

3力学信号在PDLF内的信号转导3.2离子通道

3力学信号在PDLF内的信号转导3.3蛋白激酶与机械应力

3力学信号在PDLF内的信号转导3.4机械应力与转录因子、相关基因表达

3力学信号在PDLF内的信号转导3.5整合素

参考文献

致谢

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