卵巢粒层细胞瘤中抑癌基因甲基化及组蛋白甲基化的研究

摘要

目的:卵巢粒层细胞瘤是一种少见的卵巢性索-间质肿瘤，约占卵巢恶性肿瘤的2-5％左右，按照其组织病理学类型可分为成年型及幼年型，其中以成人型最为多见，目前发生机制不明;粒层细胞瘤的临床表现缺乏特异性，主要为腹痛腹胀、内分泌紊乱及腹部包块，术前一般难以明确诊断，确诊主要靠术后病理;镜下形态复杂多样，按肿瘤细胞的排列方式可以分为微滤泡型、小梁型、岛状型及弥漫型等，各种方式常以不同比例混合存在，为粒层细胞瘤的诊断及组织学分级造成困难;粒层细胞瘤的诊断指标相对单一，主要为常规HE染色加免疫组织化学染色辅助，而现阶段用于粒层细胞瘤诊断的一线免疫组化抗体如a-inhibin、CD99、calretinin、EMA、vimentin等的敏感性和特异性均难以满足日常工作的需要;在治疗和预后方面，粒层细胞瘤具有低度恶性、远期复发的特性，迄今为止尚无充分的证据表明放化疗能延缓或预防其复发。近年来，表观遗传学的发展突飞猛进，表观调控异常与肿瘤发生发展的关系亦成为新的研究热点。表观调控异常是指不发生DNA序列变化的基因表达的改变，主要包括DNA甲基化及组蛋白甲基化。越来越多的研究显示，抑癌基因启动子甲基化及组蛋白甲基化可以沉默相应抑癌基因的表达，在肿瘤的发生与发展中发挥重要作用;研究同时发现DNA甲基化及组蛋白甲基化均具有可逆转特性，去甲基化处理可以重新激活沉默的抑癌基因的表达，发挥抑癌功能，从而使甲基化酶抑制剂类药物的研究成为抗肿瘤治疗的新思路。本课题拟通过对卵巢粒层细胞瘤(Ovary.Granulosa CellTumors，GCTs)中抑癌基因启动子甲基化及组蛋白甲基化状况的研究，为粒层细胞瘤的发生机制、诊断及治疗寻找新的研究靶点。
　　方法:(1)收集2010-2013年间齐鲁医院及单县中心医院成人型卵巢粒层细胞瘤共30例作为研究对象（年龄23-71岁，中位年龄50岁），同时收集卵巢滤泡囊肿30例作为对照，其中五例为上述粒层细胞瘤合并的对侧卵巢滤泡囊肿，另25例为同时期同年龄段因子宫肌瘤等病变手术时切除的卵巢滤泡囊肿。(2)所用病例均经齐鲁医院病理科两名高级职称专家双盲复审阅片，证实诊断准确可靠，同时挑选出合适的组织蜡块。(3)收集所有粒层细胞瘤患者的临床病理指标，包括年龄、肿瘤大小、FIGO分期、有无复发转移。(4)运用甲基化特异性PCR(methylation-specific PCR，MSP)检测30例卵巢粒层细胞瘤组织标本及30例卵巢滤泡囊肿组织标本中3个抑癌基因(tumor supper-ssor genes，TSGs) CDH13，DKK3，FOXL2启动子的甲基化状态。(5)采用免疫组织化学(immunohistochemi-stry，IHC)两步法检测组蛋白甲基化酶EZH2蛋白在卵巢粒层细胞瘤及滤泡囊肿标本中的表达状况。(6)利用Fisher's确切概率法分析抑癌基因(CDH13，DKK3，FOXL2)甲基化与卵巢粒层细胞瘤临床病理特征的相关性。(7)利用Fisher's确切概率法分析组蛋白甲基化酶EZH2的表达与卵巢粒层细胞瘤临床病理特征的相关性。(8)利用X2检验法分析抑癌基因(CDH13，DKK3，FOXL2)甲基化率与组蛋白甲基化酶EZH2表达率的相关性。(9)从上述30例粒层细胞瘤中随机挑选出10例，利用巢氏PCR法对10例粒层细胞瘤进行SNP检测，检测CDH13，DKK3外显子及FOXL2突变热点C134W基因序列有无改变。
　　结果:(1)在30例卵巢粒层细胞瘤中三个抑癌基因CDH13，DKK3和FOXL2的甲基化率分别为86.67％、80％和70％，显著高于滤泡囊肿（分别为23.33％、26.67％和20％），差异具有统计学意义，均显示p＜0.01。(2)30例卵巢粒层细胞瘤中11例EZH2蛋白呈阳性表达（阳性率为36.7％），而30例滤泡囊肿组织均呈阴性（阳性率为0％），差异具有统计学意义，p＜0.01。(3)本组数据未发现粒层细胞瘤中三个抑癌基因CDH13，DKK3和FOXL2的甲基化与临床病理指标间（年龄、肿瘤大小、FIGO分期及转移复发情况）存在统计学相关性(P＞0.05)。(4)本组数据未发现粒层细胞瘤中组蛋白甲基化酶EZH2的表达与临床病理指标间（年龄、肿瘤大小、FIGO分期及转移复发情况）存在统计学的相关性(P＞0.05)。(5)本组数据未发现卵巢粒层细胞瘤中抑癌基因CDH13，DKK3和FOXL2的甲基化率与组蛋白甲基化酶EZH2的表达率之间存在统计学相关性(P＞0.05)。(6)10例粒层细胞瘤中，CDH13全部外显子未发现有集中突变点，仅个别病例在二、五、九号外显子检测到散在的突变点;(7)10例粒层细胞瘤中有4例在DKK3基因七号外显子检测到A--＞G突变;10例粒层细胞瘤均发现在FOXL2-C134W位点存在C--＞G突变。
　　结论:(1)三个抑癌基因CDH13，DKK3和FOXL2启动子甲基化率均达到70％及以上，并显著高于卵巢滤泡囊肿，提示三者的甲基化在卵巢粒层细胞瘤中属于频发事件，推测其在卵巢粒层细胞瘤的发生中具有重要作用，可以作为粒层细胞瘤敏感性较强的诊断性指标。(2)粒层细胞瘤中组蛋白甲基化酶ZEH2的表达率虽低于抑癌基因CDH13，DKK3和FOXL2的甲基化率，但显著高于其在滤泡囊肿中的表达率，且在全部30例滤泡囊肿中失表达，提示组蛋白甲基化可能在粒层细胞瘤的发生中发挥一定作用;同时提示其作为粒层细胞瘤诊断性指标，敏感性较差，而特异性较高，可以和CDH13，DKK3及FOXL2甲基化联合应用，提高卵巢粒层细胞瘤诊断率。(3)本课题未发现抑癌基因CDH13，DKK3和FOXL2启动子甲基化及组蛋白甲基化酶EZH2的表达率与粒层细胞瘤的临床病理指标存在相关性，提示CDH13，DKK3和FOXL2启动子甲基化及组蛋白甲基化可能是卵巢粒层细胞瘤发生的早期事件，与其发生有关，而与其进展及预后无关;亦可能与粒层细胞瘤自身低度恶性、进展缓慢和远期复发的特性有关，需要进行长期随访进一步研究分析;抑或与本课题研究样本小有关，需要有大样本的研究进一步探讨。(4)组蛋白有多种不同的甲基化模式，EZH2可靶向催化H3K27发生三甲基化，并进一步发挥促进肿瘤发生的作用。本课题未发现粒层细胞瘤中抑癌基因CDH13，DKK3和FOXL2启动子甲基化率与组蛋白甲基化酶EZH2表达率之间存在统计学相关性，DNA甲基化与组蛋白H3K27甲基化之间可能不存在交互作用。提示在粒层细胞瘤中，某些抑癌基因的甲基化与组蛋白的某种类型甲基化可能通过各自的途径沉默抑癌基因的表达，促进粒层细胞瘤的发生。(5)本课题在10粒层细胞瘤中未检测到CDH13的十四个外显子存在集中突变点，仅个别病例在个别外显子检测到散在突变点，提示CDH13启动子甲基化可能单独起作用，不改变基因序列而沉默相关基因的表达，降低相关蛋白水平，促进肿瘤的发生。逆转启动子的甲基化则可能重新启动CDH13的表达活性，使相应的RNA转录量及蛋白水平显著增加，发挥抑癌作用。(6)10例粒层细胞瘤中有4例在DKK3基因七号外显子检测到A--＞G突变，文献中尚未见报道，可以经过转录、翻译造成相应的氨基酸由精氨酸R转变为甘氨酸G，有可能因此而改变相应蛋白的功能，与DKK3启动子甲基化共同作用，促进粒层细胞瘤的发生;有关DKK3七号外显子在其他肿瘤中是否存在A--＞G突变及其意义，文献中尚未见相关报道。(7)本课题研究发现10例卵巢粒层细胞瘤中FOXL2-C134W位点均存在C--＞G突变，与文献报道一致，是成人型卵巢粒层细胞瘤的一个特征性分子事件。(8)本课题发现在10例卵巢粒层细胞瘤有7例同时发生FOXL2启动子高甲基化与FOXL2-C134W的C--＞G突变，3例同时发生DKK3启动子的高甲基化与DKK3七号外显子A--＞G突变，提示在卵巢粒层细胞瘤中，特定抑癌基因的甲基化可能通过某种机制造成特点位点基因序列的改变;亦有可能作为表观调控的异常，抑癌基因启动子甲基化本身并不改变基因序列，但可能与基因突变同时存在。若二者为同时存在，逆转启动子的甲基化则无法同时逆转基因序列的改变，并不能重新激活基因的表达活性，单纯去甲基化治疗则可能无效，从而为以去甲基化为靶点的药物的研发作出了有益的提示。因本研究样本较小，无法对DKK3启动子的高甲基化与DKK3七号外显子A--＞G突变、FOXL2启动子甲基化与FOXL2-C134W位点突变的相关性作进一步的统计学分析，二者间的相关性及其可能的发生机制需要通过对大样本的深入研究进一步探讨。

目录

声明

摘要

中英文缩写词对照表

前言

1 DNA甲基化

2 组蛋白修饰

3 DNA甲基化与组蛋白修饰的相互作用

4 表观遗传类药物的应用价值

材料与方法

1 临床资料

2 实验方法

结果

1．CDH13 DKK3和FOXL2基因启动子在卵巢粒层细胞瘤及滤泡囊肿组织的甲基化状态

2 CDH13 DKK3和FOXL2基因启动子甲基化与箩同巢粒层细胞瘤临床病理指标的相关性分析

3 卵巢粒层细胞瘤中EZH2的表达情况

4 EZH2与卵巢粒层细胞瘤临床病理指标的相关性分析

5 CDH13、DKK3和FOXL2启动子甲基化与EZH2表达的相关性分析

6 CDH13 DKK3和FOXL2在卵巢粒层细胞瘤中基因测序情况

讨论

1 抑癌基因启动子甲基化在卵巢粒层细胞瘤中的意义

2． EZH2高表达在卵巢粒层细胞瘤中的意义

3．抑癌基因甲基化及组蛋白甲基化与卵巢粒层细胞瘤临床病理特征相关性分析

4．粒层细胞瘤中抑癌基因启动子甲基化与组蛋白甲基化之间交互作用的研究

5．粒层细胞瘤中同时发现抑癌基因甲基化及基因突变的意义

结论

附图表

参考文献

综述 FOXL2基因及其与卵巢粒层细胞瘤关系的研究

致谢

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