弯曲菌地方分离株毒力相关基因分析及HT-29细胞感染模型的建立与应用

摘要

空肠弯曲菌是全球性引起胃肠道感染的主要病原菌之一，并与格林一巴利综合症(GBS)及米尔－费歇综合症(MFS)等神经系统疾病的发生关系密切。由于缺乏适当的实验模型，目前对空肠弯曲菌的遗传学特性、毒力因子和致病机理了解甚少。本研究的主要内容是：(1)对我国部分地区不同来源的空肠弯曲菌和结肠弯曲菌分离株毒力相关基因进行分析；(2)通过建立体外细胞模型，研究空肠弯曲菌分离株的黏附、侵袭和增殖特性，开展空肠弯曲菌的侵袭能力与毒力相关基因间相互关系的初步分析。 一、弯曲菌地方分离株毒力相关基因的分析为了解我国部分地区弯曲菌分离株中10种毒力基因的携带情况，本研究对分离自腹泻病人、鸡、牛和市场流通的453株空肠弯曲菌和40株结肠弯曲菌进行基因检测和分析。结果表明：结肠弯曲菌分离株各基因的携带率均低于空肠弯曲菌。453株空肠弯曲菌中黏附相关基因cadF、pebA、racR平均携带率分别为91.39％、95.36％和97.79％，趋化性调节基因 cheY、docA平均携带率分别为95.81％和92.27％，侵袭蛋白基因iamA平均携带率为85.87％，鞭毛蛋白基因flaA平均携带率为83.66％，而细胞致死性扩张毒素基因cdt、LOS合成相关基因wlaN、质粒基因virB11平均携带率仅为72.19％、48.12％和6.57％。同一种基因在不同来源空肠弯曲菌分离株中的分析结果显示，人源分离株flaA、virB11基因携带率较高，牛源分离株 cadF、docA、cheY和iamA基因携带率较高，市场分离株peblA、racR、cdt和wlaN基因携带率较高，鸡源分离株各基因携带率在所有种类分离株中处于中间水平。453株空肠弯曲菌中，86.75％的细菌含有6个以上的毒力相关基因，但由于不同宿主的特异性，不同来源分离株的毒力基因存在较大差异，由此推测，空肠弯曲菌对不同宿主的致病机理可能存在不同。二、空肠弯曲菌分离株HT-29细胞感染模型的建立与应用本研究以人结肠癌细胞系HF-29为材料，建立空肠弯曲菌体外细胞感染模型，用以测定不同来源空肠弯曲菌分离株对HT-29细胞的黏附、侵袭和增殖能力，并对空肠弯曲菌的侵袭能力与毒力基因之间的关系展开初步分析。42株不同来源的空肠弯曲菌分离株黏附、侵袭和增殖实验显示：不同细菌对HT-29细胞的吸附、侵袭和增殖能力存在一定差异，其中11株细菌没有黏附、侵袭和增殖能力、13株细菌没有侵袭和增殖能力、3株细菌没有增殖能力、其余15株细菌同时具有黏附、侵袭和增殖能力，且15株细菌对HT-29细胞的平均黏附效率为0.2270％、平均侵袭效率为0.0778％、平均增殖倍数为12.55倍。 212株腹泻病人源和鸡源空肠弯曲菌分离株的侵袭力实验表明：54.72％的细菌无侵袭能力，15.09％的细菌侵袭效率在0.0001％-0.01％之间，14.75％的细菌侵袭效率在0.01％-0.1％之间，12.74％的细菌侵袭效率在0.1％-2％之间。腹泻病人源分离株侵袭HT-29细胞能力显著高于鸡源分离株。 不同侵袭能力分离株毒力相关基因分析显示：cadF、peblA、docA和flaA基因携带率随着细胞侵袭力的增强而下降，racR、cheY和iamA基因在不同侵袭力菌株间差异不显著，而virB11、wlaN和cdt等毒素基因携带率随细胞侵袭力的增强而上升。不同侵袭力鸡源空肠弯曲菌毒力相关基因与人源空肠弯曲菌相比，cadF、racR、oeblA、cheY，、docA、wlaN和flaA等基因携带情况无显著差异，但iamA、cdt、virB11基因携带存在显著差异，这种差异可能是导致人源分离株HT-29细胞侵袭力高于鸡源分离株的原因之一。

目录

论文说明：符号说明

第一章文献综述

第二章弯曲菌地方分离株毒力相关基因的分析

1材料和方法

1.1材料

1.2菌株鉴定

1.3细菌DNA模板的制备

1.4 PCR扩增体系

2结果

2.1分离株鉴定

2.2毒力相关基因PCR扩增结果

2.3 453株空肠弯曲菌毒力相关基因的分析

2.4人源空肠弯曲菌毒力相关基因的分析

2.5鸡源空肠弯曲菌毒力相关基因的分析

2.6牛源空肠弯曲菌毒力相关基因的分析

2.7市场源空肠弯曲菌毒力相关基因的分析

2.8结肠弯曲菌分离株毒力相关基因的分析

3讨论

第三章空肠弯曲菌分离株HT-29细胞感染模型的建立与应用

1材料与方法

1.1材料

1.2方法

2结果

2.1 42株空肠弯曲菌对HT-29细胞的黏附、侵袭及胞内增殖试验

2.2 212株空肠弯曲菌分离株对HT-29细胞侵袭试验

2.3不同侵袭力空肠弯曲菌毒力相关基因的分析

3讨论

参考文献

致谢

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