苏姜猪初情期启动基因的发育性变化及差异显示研究

摘要

初情期是动物首次出现发情排卵的年龄，是开始获得繁殖能力的标志。初情期的启动，是由下丘脑GnRH神经元控制。从目前的研究报道看，初情期启动的机制实际上是GnRH脉冲式释放的调控，是非类固醇介导的中枢机制，调控因素包括神经肽、神经递质、神经类固醇。主要参与调控GnRH释放的神经肽有鸦片肽、NPY、促生长激素神经肽(Galanin)、促皮质激素释放激素(CRF)；神经递质有去甲肾上腺素(NE)、多巴胺、5-羟色胺、褪黑激素、γ氨基丁酸(GABA)，但其具体调控机制还需进一步研究探讨。目前，关于初情期启动相关基因受体NPY-Y1、GPR54、Ob-Rb基因的研究报道较少，特别是关于他们对初情期启动的调控机制几乎没有报道。本研究系统的研究初情期启动相关基因受体NPY-Y1、GPR54、Ob-Rb基因在下丘脑-垂体-卵巢内的组织定位及其组织发育性变化，目的是为深入研究探讨NPY-Y1、GPR54、Ob-Rb在初情期启动中扮演的角色。同时本实验还采用mRNA差异显示(mRNADD)技术对猪初情期启动的关键因子做进一步的研究，以筛选与猪初情期启动相关的重要基因。主要研究结果如下：
　　 1.根据GenBank发表的序列设计NPY-Y1、GPR54、Ob-Rb基因特异性引物，采用反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)扩增出NPY-Y1、GPR54、Ob-Rb基因的部分cDNA序列，扩增产物克隆入pGEM-T easy载体中进行序列测定。结果：与发表的猪NPY-Y1、GPR54、Ob-Rb基因序列(NO.AF106081，NO.DQ459346，NO.AF092422)同源性均为100％，说明所扩增的序列为本实验所要的，为后续研究奠定了基础。
　　 2.用原位杂交技术检测苏姜猪母猪初情期前后NPY-Y1 mRNA在下丘脑、垂体和卵巢的分布定位。结果：在苏姜猪初情期前后下丘脑、垂体和卵巢三种组织中，均检测到NPY-Y1 mRNA阳性杂交信号。下丘脑的阳性杂交信号主要集中在丘脑室旁核和下丘脑的弓状核、室旁核、室周核等处；在垂体中分布相对密集；各级卵泡颗粒细胞和内膜细胞中均有阳性杂交信号，间质中也有少量的杂交信号。在三种组织中NPY-Y1 mRNA杂交信号均初情期较弱，初情期前相对较强。结果可以初步证明NPY-Y1在下丘脑-垂体-卵巢轴对雌性生殖的调节中具有关键的调控作用，并且对下丘脑-垂体-卵巢轴具有调控作用。
　　 3.用原位杂交技术检测苏姜猪母猪初情期前后GPR54 mRNA在下丘脑、垂体和卵巢的分布定位。结果：在苏姜猪初情期前后下丘脑、垂体和卵巢三种组织中，均检测到GPR54 mRNA阳性杂交信号。下丘脑的阳性杂交信号主要集中在弓状核和腹内侧核中，其它区也有一定的表达；在垂体中分布相对密集；各级卵泡颗粒细胞和内膜细胞中均有阳性杂交信号，间质中也有少量的杂交信号，大卵泡的阳性率明显高于小卵泡。在三种组织中GPR54 mRNA杂交信号均初情期较强，初情期前相对较弱些。结果可以初步证明GPR54在下丘脑-垂体-卵巢轴对雌性生殖的调节中具有关键的调控作用，并且对下丘脑-垂体-卵巢轴具有调控作用。
　　 4.用免疫组织化学的方法测定苏姜猪母猪初情期前后下丘脑、垂体、卵巢内Ob-Rb的分布及定位。结果：Ob-Rb阳性颗粒广泛分布于下丘脑，尤其是弓状核；垂体中Ob-Rb阳性颗粒主要集中于垂体前叶细胞；卵巢中Ob-Rb阳性颗粒出现在各级卵泡的颗粒细胞，而卵母细胞没有阳性颗粒。结果可以初步证明Ob-Rb在下丘脑-垂体-卵巢轴对雌性生殖的调节中也具有关键的调控作用。
　　 5.用荧光定量PCR技术检测苏姜猪初生、60、120、初情期、180日龄五个不同发育阶段的下丘脑、垂体和卵巢三种组织中NPY-Y1、GPR54、Ob-Rb mRNA的表达丰度变化。结果：(1)下丘脑、垂体与卵巢内NPY-Y1 mRNA表达量从初生到初情期表达量逐渐下降，在初情期达到最低，初情期后呈上升趋势。下丘脑内各个时期NPY-Y1 mRNA表达量均存在显著差异(P＜0.05)，垂体内120日龄与180日龄之间NPY-Y1 mRNA表达量差异不显著(P＞0.05)，其它时期NpY-Y1 mRNA表达量均显著差异(P＜0.05)，卵巢内初情期与180日龄之间NPY-Y1 mRNA表达量差异不显著(P＞0.05)，其它时期NPY-Y1 mRNA表达量均显著差异(P＜0.05)。(2)下丘脑、垂体与卵巢内GPR54 mRNA表达量均从初生到初情期表达量逐渐上升，在初情期达到最高，初情期后呈下降趋势。下丘脑内初情期与初生、180日龄的GPR54 mRNA表达量差异均达到显著水平(P＜0.05)，垂体内初情期与初生、60日龄、180日龄的GPR54 mRNA表达量差异均达到显著水平(P＜0.05)，卵巢内初情期与初生、60日龄、120日龄、180日龄的GPR54 mRNA表达量差异均达到显著水平(P＜0.05)。(3)下丘脑、垂体与卵巢内Ob-Rb mRNA发育性变化模式与NPY-Y1基本相同，从初生到初情期表达量逐渐下降，在初情期达到最低，初情期后呈上升趋势。下丘脑内120日龄、初情期与180日龄之间Ob-Rb mRNA表达量差异不显著(P＞0.05)，其它时期NPY-Y1 mRNA表达量均显著差异(P＜0.05)，垂体内60日龄与120日龄之间Ob-Rb mRNA表达量差异不显著(P＞0.05)，其它时期NPY-Y1 mRNA表达量均显著差异(P＜0.05)，卵巢内初情期与180日龄之间Ob-Rb mRNA表达量差异不显著(P＞0.05)，其它时期Ob-Rb mRNA表达量均显著差异(P＜0.05)。结果初步显示了三种受体在猪下丘脑-垂体-卵巢生殖轴中不同发育时期的变化，并且证明发育时期中NPY对GnRH释放起到是抑制作用，而leptin对GnRH起释放作用，低剂量的leptin可促进GnRH-LH的分泌，高浓度则抑制其分泌，这为以后的研究提供了可靠的科学数据。
　　 6.采用mRNA差异显示技术、Reverse Northern技术以及半定量分析技术，对不同发育时期猪下丘脑差异表达的ESTs进行分离，共得到cDNA差异片断20条，半定量分析显示：其中5条差异条带在出生时呈表达增强相，11条差异条带在初情期时呈表达增强相，其余4条在性成熟时呈表达增强相。测序结果与GenBank数据库比对，二个cDNA与已知基因同源，其余大部分都是功能未知的EST序列。经Reverse Northern验证，有9个cDNA呈阳性，可用于下一步探针定位及表达的研究。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：部分缩写的中英文对照

声明

第一章文献综述

一、初情期启动相关基因的研究进展

1、初情期启动的概述

2、NPY的研究进展

3瘦素的研究进展

4 GPR54的研究进展

二、差异显示技术及其在动物繁殖新技术上的应用进展

1 DDRT-PCR的原理

2 DDRT-PCR的引物设计

3 DDRT-PCR参数的优化

4 DDRT-PCR假阳性的鉴定方法

5应用非放射性同位素mRNA差异显示技术

6 DDRT-PCR的发展

7 DDRT-PCR的优点与局限性

8 DDRT-PCR技术在猪繁育方面的应用

三研究目的与意义

第二章猪NPY-Y1、GPR54、Ob-Rb基因的克隆与分析

1材料与方法

1.1实验材料

1.2实验方法

1.3相关软件

2结果与分析

2.1总RNA的检测

2.2 NPY-Y1基因的克隆与分析

2.3 GPR54基因cDNA的克隆与序列分析

2.4 Ob-Rb基因的克隆与分析

3讨论

3.1高保真Pfu的忠实性

3.2初情期启动的相关激素、肽和神经递质

3.3 NPY-Y1基因

3.4 GPR54基因

3.5 Ob-Rb基因

第三章猪初情期前后相关基因在下丘脑-垂体-卵巢轴内的表达定位

1材料与方法

1.1实验动物

1.2主要试剂

1.3主要仪器

1.4样品的采集

1.5冰冻切片的制备

1.6原位杂交(ISH)

1.7免疫组化

2结果与分析

2.1 NPY-Y1在下丘脑、垂体、卵巢的分布定位

2.2 GPR54在下丘脑、垂体、卵巢的分布定位

2.3 Ob-Rb在下丘脑、垂体、卵巢的分布定位

3讨论

3.1下丘脑-垂体-卵巢轴调控

3.2初情期前后NPY-Y1 mRNA在下丘脑-垂体-卵巢轴内的定位

3.3初情期前后GPR54 mRNA在下丘脑-垂体-卵巢轴内的定位

3.4初情期前后Ob-Rb在下丘脑-垂体-卵巢轴内的定位

第四章猪NPY-Y1、GPR54、OB-Rb在下丘脑-垂体-卵巢内的发育性变化研究

1材料与方法

1.1实验材料

1.2实验方法

2结果与分析

2.1 RNA鉴定

2.2基因扩增与克隆测序

2.3 QRT-PCR结果

2.4下丘脑、垂体与卵巢内NPY-Y1 mRNA表达实时荧光定量检测

2.5下丘脑、垂体与卵巢内GPR54 mRNA表达实时荧光定量检测

2.6下丘脑、垂体与卵巢内Ob-Rb mRNA表达实时荧光定量检测

3讨论

3.1荧光定量PCR技术

3.2动物初情期的启动

3.3下丘脑-垂体-卵巢内NPY-Y1 mRNA的发育性变化

3.4下丘脑-垂体-卵巢内GPR54 mRNA的发育性变化

3.5下丘脑-垂体-卵巢内0b-Rb mRNA的发育性变化

3.6 NPY-Y1、GPR54、Ob-Rb基因的表达的相关性

第五章应用差异显示技术对猪初情期启动关键因子的研究

1材料与方法

1.1实验动物与样品采集

1.2主要试剂

1.3主要引物

1.4组织总RNA的提取

1.5反转录--cDNA第一链的获得

1.6 DDRT-PCR

1.7琼脂糖、聚丙烯酰胺凝胶电泳

1.8差异片段的回收及二次PCR

1.9 Reverse Northern杂交法剔除不同发育时期猪下丘脑内ESTs的假阳性

1.10半定量法检测ESTs在不同发育时期猪下丘脑内的表达

2结果与分析

2.1总RNA样品制备的结果

2.2 DDRT-PCR结果

2.3差异片段回收及二次PCR

2.4 Reverse Northern杂交剔除假阳性干扰

2.5差异片段测序及比对

2.6半定量RT-PCR检测差异条带的表达

3讨论

3.1反应所用引物的筛选

3.2反应条件对试验结果的影响

3.3不同差异条带回收的方法对获得差异表达ESTs的量的变化

3.4采用改进后的差异显示技术对本实验结果的影响

3.5采用半定量技术对本实验结果的影响

3.6差异序列的生物信息学分析

全文结论

参考文献

致谢