shRNA抑制猪繁殖与呼吸综合征病毒在Marc145细胞中复制的研究

摘要

猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive and respi ratory syndromevirus，PRRSV)属于尼多病毒目动脉炎病毒科，它主要引起母猪早产、流产等繁殖障碍，仔猪、育肥猪呼吸困难及育成猪类流感疾病，此外该病毒持续性感染，可引起免疫抑制，成为危害世界养猪业安全的重要病原之一。然而，目前疫苗的使用只能够提供部分保护使机体不再出现临床症状，不能够阻止感染，因此，迫切需要开发一种新型的、能对所有PRRSV病毒株提供保护的抗病毒措施。 RNA干扰是由双链RNA(dsRNA)引发的信使RNA(mRNA)序列特异性消减现象，是一种保守的抗病毒机制，已发现于线虫、植物和哺乳动物中。将21～2 3nt的小分子干扰RNA双链(sma ll interfererlce RNA，s iRNA)或载体DNA转录的发夹RNA (shor thairpin RNAs，shRNAs)导入细胞，可以抑制同源的内源或病原mRNA的表达。近几年，RNAi技术已被用于干扰HBV、HCV、流感和其他人类病毒的感染研究，提示RNAi作为一个有效的抗病毒策略，具有很大应用前景，但是目前对于PRRSV是否存在RNA干扰现象，究竟哪些基因哪些序列是合适的靶标，shRNA对PRRsV抑制有哪些特征等等，尚没有这方面的研究。 为了探讨psUPER质粒能否有效表达发夹小干扰RNA(shRNA)，作为RNAi研究的平台，本研究利用RNA干扰技术，以A型流感病毒核衣壳蛋白(NP)基因为靶基因，选用已知的有高效抑制效果的siRNA片段，设计有小发夹结构的两条寡核苷酸序列，经退火成互补双链，再克隆至质粒pSUPER中，经酶切鉴定和测序证实表达质粒构建成功，命名为pSUPER-NP。将该表达质粒转染鸡胚成纤维细胞(cEF)，24h后用A型流感病毒感染，病毒感染40h后观察细胞病变，测定病毒血凝效价和TCID<,50>，发现psUPER-NP能够阻止细胞病变的出现，pSUPER-NP转染孔的血凝价和TcID<,50>均显著下降，表明该表达质粒能抑制流感病毒的复制，pSUPER质粒可以应用于哺乳动物高效的RNAi研究，也为探索流感病毒致病机理和开发基因治疗新途径奠定了基础。 RNAi抑制效果的正确评价，需要合适的检测方法，为了建立灵敏、快速的mRNA检测方法，本研究设计合成了一套引物和TaqMan探针，以扩增猪繁殖与呼吸综合征病毒的核衣壳蛋白基因，通过反应条件的优化，建立了快速定量检测猪繁殖与呼吸综合征病毒的实时PCR方法，并用该法检测患病猪的肺脏等样品。结果表明该方法具有较好的特异性和重复性，对PRRsV细胞培养物的检测下限为0.01TcID<,50>，敏感性比常规RT-PCR高100倍；对10份PRRS疑似猪肺脏样品检测5份为阳性，与病毒分离的阳性符合率为100％。该方法具有快速、灵敏、准确、低污染等优点，在PRRSV的早期检测、预防控制、进出口检疫及基础研究中会起到重要作用。转染效率低是阻碍siRNA介导的基因沉默效果的重要因素，为了实现质粒在Marc145细胞中的最佳转染，本研究以荧光质粒pEGFP为报告质粒，通过对转染试剂的选择、脂质体质粒比例、细胞密度和最佳质粒转染量的优化，确定了质粒转染Marc145细胞的最佳转染条件，即转染前24h将96孔板每孔铺10><'4>个细胞，转染前4h将细胞换液，转染时TransFast<'TM> Transfection Reagent与质粒比(μL／μg)为3:1，每孔转染0.4μg的pEGFP(24孔板每孔1.0μg)时，转染孔的荧光数最多，荧光强度最大，转染效率最高，从而为下一步的shRNA表达质粒高效转染Marc145细胞奠定了基础。 不同基因不同区域上的siRNA抑制基因表达的能力差异很大，为了筛选PRRSV基因组上功能性的shRNA分子，本研究利用Ambion公司的在线设计工具httD：www．ambion．com／techlib／misc／siRNA design html，根据siRNA设计原则，选择了针对PRRSV S1株PA、GP5、M、N基因及5’UTR序列的14个siRNA靶序列，经BLAST验证，所选择的靶序列与猪体和其他病毒基因片段无同源性。根据pSUPER载体要求，合成了14对互补的寡核苷酸，寡核苷酸的结构为：5’端19个核苷酸为siRNA的正义链，中间加入9个核苷酸TTCAAGAGA间隔以形成发夹结构，19个核苷酸siRNA的反义链，3’端加有转录终止信号TTTTT。并且正义链寡核苷酸5’端带有Bg1Ⅱ(GATC)酶切位点粘性末端，反义链寡核苷酸5’端带有Xho Ⅰ(TCGA)酶切位点粘性末端。将各对寡核苷酸分别退火，克隆到pSUPER载体上。经EeoR I／Kpn I双酶切鉴定和测序鉴定后，证明已成功构建了针对相应基因不同区域的shRNA(small hairPin RNA)表达质粒。为进一步进行RNA干扰试验奠定了基础。 为了验证上述构建的shRNA表达质粒表达的shRNA对靶基因表达的抑制，本研究首先根据PRRSV S1株病毒基因组序列设计5对特异性引物，分别扩增GP5、M、N基因及PA和5’UTR部分序列，经HindⅢ／BamH I克隆到pEGFP-N1载体，构建了5个EGFP融合表达质粒。将融合表达质粒转染HEK293A细胞，分别在24h，48h，72h观察荧光的变化。结果发现各蛋白均得到了表达，转染后24h就可见到荧光，48h荧光增强，72h最强，然后逐渐减弱；p1b-EGFP-N1、pUTR-EGFP-N1、pGP5-EGFP-N1表达的蛋白主要在胞浆，呈弥散状充盈整个细胞；而pN-EGFP-N1转染的孔荧光主要在胞浆和胞核；pM-EGFP-N1表达的蛋白24h在胞浆和核周区，呈圆圈状，有的在核周两极浓染，48h-72h主要集中在胞浆和核仁。将shRNA表达质粒与构建的融合表达质粒分别两两共转染HEK293A细胞，分别在转染后48h观察荧光的变化。结果发现，shRNA质粒共转染细胞的孔荧光均有不同程度的减弱，荧光细胞数减少，其中pSUPER-N3、pSUPER-G1、pSUPER-G2、pSUPER-M2、pSUPER-M3、pSUPER-P2、pSUPER-P3质粒共转染的孔荧光减少得较为明显。将shRNA表达质粒与表达PRRSV结构蛋白GP5、M和N的pCDNA3真核表达质粒分别两两共转染HEK293A细胞，通过半定量PCR检测在mRNA水平上来验证这些shRNA表达载体对结构基因表达的抑制，结果表明GP5、M和N蛋白基因shRNA表达载体对其各自蛋白的抑制率为36％-69％，其中pSUPER-N3和pSUPER-GI抑制效果最为显著。为了探讨上述有显著抑制效果的shRNh对PRRSV复制的抑制作用，本研究将7个靶向PRRSV基因组中的GP5和N蛋白基因shRNA表达质粒和pSUPER转染Marcl45细胞，研究靶向PRRSV基因组中的GP5和N蛋白基因的shRNA抑制PRRSV在Marcl45细胞中复制的情况。结果表明shRNA表达质粒表达的shRNA在PRRSV感染后48h对病毒复制的抑制达到10-1000倍，其中pSUPER-N3、pSUPER-G1的抑制效果最为明显，将这两种质粒共转染Marc145细胞，发现能够提高shRNA对病毒的抑制作用，表明shRNA表达质粒对病毒复制的抑制作用具有相加性，而且这种抑制作用能持续到感染后4d。通过对SiRNA点突变，构建了靶向同一序列的突变体shRNA表达质粒，将其转染Marcl45细胞，病毒的复制不受其影响，表明这种抑制作用序列特异性。将不同剂量的pSUPER-N3或pSUPER-G1转染Marcl45细胞，发现随着剂量的增加shRNA对病毒复制的抑制作用也有所增强，呈现出剂量依赖性抑制，而且用shRNA表达质粒转染已经感染PRRSV的Marcl45细胞，病毒的复制也得到了抑制，这些研究表明靶向PRRSV基因组不同区域的siRNA可以作为控制该病毒传播的候选策略。本研究也观察了靶向PRRSV基因组5'UTR及PA、M基因的siRNA抑制PRRSV在Marc145细胞中的复制，以进一步筛选PRRSV基因组5'UTR及PA、M基因上的功能性shRNA。将shRNA表达质粒转染Marcl45细胞，24h后用PRRSV感染，病毒感染后48h通过间接免疫荧光、TCID<,50>测定和实时PCR来检测shRNA对PRRSV复制的抑制。结果表明转染了shRNA表达质粒的细胞孔荧光数目均有不同程度的减少，TCID<,50>测定和实时PCR结果显示，siRNA在PRRSV感染后48h对病毒复制的抑制达到10-500倍，其中pSUPER-P2、pSUPER-P3的抑制效果最为明显，这些研究表明靶向PRRSV基因组PA基因不同区域的siRNA也可以作为控制该病毒传播的RNAi候选分子。

目录

文摘

英文文摘

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第一章猪繁殖与呼吸综合征病毒研究进展

第二章siRNA干扰病毒复制研究进展

第三章pSUPER质粒作为RNAi研究平台的可行性分析

第四章猪繁殖与呼吸综合征病毒实时PCR检测方法的建立

第五章质粒转染Marc145细胞条件的优化

第六章PRRSV不同ORFs 基因和5’UTR序列shRNA表达质粒的构建与鉴定

第七章PRRSV 不同 ORFs 基因和5’UTR序列shRNA对靶基因转录和表达的特异性抑制

第八章PRRSV ORF5和ORF7编码区shRNA抑制PRRSV在Marc145细胞中复制的研究

第九章PRRSV ORF1b、ORF6编码区和5’UTR shRNA抑制PRRSV在Marc145细胞中复制的观察

全文总结

致谢

攻读博士学位期间发表的论文