Bacillus sp.YX-1中温酸性α-淀粉酶的分离纯化及基因克隆和表达的研究

摘要

α-淀粉酶(1，4-α-D-葡萄糖苷水解酶，EC3.2.1.1)从淀粉糖链内部水解1，4-α-D-葡萄糖苷键，开发筛选具有各种特性的α-淀粉酶成为目前酶制剂研究领域的一个重要方向。中温酸性α-淀粉酶以其中温和耐酸特性有广泛的应用领域，对于丰富淀粉酶品种具有重要实践价值。同时，认识和探寻微生物酶的耐酸特性和相关机理也有积极的理论意义。本文从筛选新酶的角度入手，从Bacillus sp. YX-1菌株中分离纯化得到一种具有新催化功能的α-淀粉酶，并对该酶的酶学特征和结构基因的克隆与表达等分子酶工程内容进行了研究。
　　 针对实验室保藏的一株编号为YX-1的淀粉酶产酶菌株(该菌株在pH4.5的固态培养基上表现出水解淀粉产透明圈的特性)进行菌体形态、生理生化以及分子生物学16SrDNA序列的鉴定，初步命名为Bacillus sp.YX-1。同时，通过比对分析发现该菌株16SrDNA序列与B.subtilis，B.licheniformis，B.stearothermophilus以及B.amyloliquefaciens等常见的α-淀粉酶生产菌株16S rDNA序列没有高同源性，而与之同源性较高的其它芽孢杆菌属菌株(Bacillus sp.)却没有相关产酶的报道。从物种进化分析结果来看，Bacillus sp。YX-1是一种与相关同源菌株存在分类差异的淀粉酶产酶新菌株。该菌株16S rDNA序列已在GenBank数据库登记，登记号为DQ883446。
　　 采用紫外诱变的方法针对Bacillus sp.YX-1进行优良产酶菌株的选育，筛选得到一株突变菌株，产酶能力与原始菌株Bacillus sp.YX-1相比有显著提高。通过培养基优化，跟踪突变菌株产酶过程，发现44 h时达到产酶峰值162.24 U/mL，是出发菌株产酶能力的3倍。对其粗酶酶学特性分析表明，与原始菌株产酶酶学性质相似。
　　 针对Bacillus sp.YX-1发酵粗酶进行了分离纯化，经硫酸铵分级沉淀、DEAE-Sepharose Fast Flow阴离子层析、Sephadex G-75凝胶过滤层析等步骤后获得电泳均一的淀粉酶，其酶蛋白的亚基分子量约为58 kDa。纯化后比活由粗酶的17.9 U/mg提高到607U/mg，纯化倍数为34倍。采用得到的纯酶对可溶性淀粉底物进行水解，并与商品化中温α-淀粉酶比较发现，该酶是一个液化型水解内切酶。
　　 采用纯化得到的Bacillus sp.YX-1α-淀粉酶，针对其主要酶学性质进行了研究。该酶最适反应pH为5.0，在pH4.5-11.0范围内稳定，具有较好的耐酸特性和广泛的稳定性。该酶最适反应温度为40-50℃，在40-60℃范围内稳定。金属离子中，Ca2+对于酶活性没有显著的影响，Na+对酶活性有激活作用。Bacillus sp.YX-1α-淀粉酶与商品化中温α-淀粉酶比较而言，在pH4.5-5.0的偏酸性条件下表现出较强的活性及稳定性；pH5.0时该酶对于多种生淀粉底物也有良好的水解作用；同时，对于15-20%的高浓度玉米生淀粉底物也都能够进行有效的水解。经LC-MASS-MASS分析得到了酶蛋白中两个肽段的氨基酸序列，通过比对发现，该酶与NCBI中已报道的α-淀粉酶序列具有一定的同源性，同时，在氨基酸水平上也存在着差异。因此，该酶是一种具有研究价值和应用前景的中温酸性α-淀粉酶。
　　 通过搜集NCBI数据库中芽孢杆菌属α-淀粉酶氨基酸序列，并根据序列的保守性和同源性设计引物，扩增获得Bacillus sp.YX-1α-淀粉酶的结构基因amy。该基因全长1545bp，编码514个氨基酸残基。该基因已在GenBank数据库登记，登记号为EU159580。将结构基因全序列amy比对分析发现，Bacillus sp. YX-1中温α-淀粉酶与芽孢杆菌属α-淀粉酶表现出较高的同源性，然而，在表观酶学性质上Bacillus sp. YX-1中温α-淀粉酶表现出较好的耐酸特性和较强的生淀粉底物水解能力。在研究中分别从酶蛋白氨基酸组成、维系酶结构稳定的空间作用力以及酶蛋白结构等多角度来阐述Bacillus sp. YX-1中温α-淀粉酶基因序列与其催化功能(酸性条件下的活性和稳定性)之间的内在联系；并从基因序列角度初步分析了紫外诱变后突变菌株产酶能力提高的机理。
　　 将Bacillus sp.YX-1中温α-淀粉酶结构基因插入表达载体pET28a中并转化相应表达宿主E.coli BL21(DE3)中成功构建带有目的基因的重组菌株E.coli BL21(DE3)(pET-28a-amy)。当诱导培养温度从37℃降低至30℃时，表达后形成的可溶性蛋白增加，并确定诱导培养条件为：诱导培养温度30℃，诱导物IPTG浓度0.5 mmol/L。在以上诱导培养条件下，该重组菌粗酶液催化活性为1.52 U/mg。利用His-tag亲和层析分离纯化了表达后的重组蛋白。

目录

文摘

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声明

第一章 绪 论

1.1 概述

1.2 中温酸性α-淀粉酶的研究进展

1.2.1 酶源及酶催化特性的生物多样性

1.2.2 中温酸性α-淀粉酶的发酵生产及分离纯化

1.2.3 中温酸性α-淀粉酶基因克隆和表达的研究

1.2.4 α-淀粉酶耐酸性机理的研究

1.2.5 定向进化技术用于α-淀粉酶的耐酸性改造

1.2.6 生淀粉水解酶类的研究进展

1.3 本课题研究内容

1.3.1 本课题研究目的和意义

1.3.2 本课题研究思路与内容

第二章 产酶菌株YX-1的分离鉴定、分类及诱变选育

2.1 前言

2.2 材料与方法

2.2.1 菌种与质粒

2.2.2 培养基与溶液

2.2.3 主要试剂

2.2.4 主要仪器

2.2.5 菌株YX-1的培养

2.2.6 电镜研究

2.2.7 生理生化特性

2.2.8 产酶菌株16S rDNA序列的扩增和分析

2.2.9 淀粉酶酶活测定方法

2.2.10 紫外诱变育种

2.2.11 淀粉酶发酵过程跟踪

2.2.12 酶的初步纯化

2.3 结果与讨论

2.3.1 菌株菌体形态以及部分生理生化特性的测定

2.3.2 16 S rDNA的PCR扩增和序列分析

2.3.3 菌株YX-1的16S rDNA序列和系统发育分析

2.3.4 紫外诱变选育优良菌株

2.4 小结

第三章 Bacillus sp.YX-1α-淀粉酶的分离纯化及其水解特征

3.1 前言

3.2 材料与方法

3.2.1 菌种

3.2.2 培养基与溶液

3.2.3 主要试剂

3.2.4 主要仪器

3.2.5 淀粉酶的培养和收集

3.2.6 淀粉酶的分离纯化

3.2.7 酶活测定方法

3.2.8 SDS-PAGE分析

3.2.9 淀粉酶活性染色

3.2.10 蛋白质含量测定方法

3.2.11 还原糖测定方法

3.2.12 酶对可溶性淀粉的水解效果及特征分析

3.3 结果与讨论

3.3.1 淀粉酶的分离纯化

3.3.2 酶的纯度检测

3.3.3 淀粉酶的纯化结果

3.3.4 Bacillus sp.YX-1淀粉酶对可溶性淀粉的水解分析

3.4 小结

第四章 Bacillus sp.YX-1中温α-淀粉酶酶学特性的研究

4.1 前言

4.2 材料与方法

4.2.1 菌种

4.2.2 培养基与溶液

4.2.3 主要试剂

4.2.4 主要仪器

4.2.5 酶活测定方法

4.2.6 蛋白质测定方法

4.2.7 还原糖测定方法

4.2.8 主要酶学性质分析

4.2.9 AMY(YX)与商品中温α-淀粉酶的催化效果的比较

4.2.10 酶对生淀粉的水解效果

4.2.11 酶的部分氨基酸序列分析

4.3 结果与讨论

4.3.1 酶的最适反应pH和pH稳定性

4.3.2 酶的最适反应温度和热稳定性

4.3.3 金属离子对酶活的影响

4.3.4 Bacillus sp.YX-1 α-淀粉酶与商品中温α-淀粉酶的水解效果的比较

4.3.5 Bacillus sp.YX-1α-淀粉酶对于生淀粉底物的水解效果

4.3.6 酶源和酶学特性生物多样性的比较

4.3.7 氨基酸序列分析

4.4 小结

第五章 Bacillus sp.YX-1中温α-淀粉酶的基因克隆及序列分析

5.1 前言

5.2 材料与方法

5.2.1 菌种与质粒

5.2.2 培养基与溶液

5.2.3 主要试剂

5.2.4 主要仪器

5.2.5 Bacillus sp.YX-1中温α-淀粉酶基因的克隆

5.2.6 pMD18-T-amy测序质粒的构建

5.2.7 大肠杆菌E.coli JM109感受态细胞的制备及转化

5.2.8 质粒的小量制备(碱裂解法)

5.2.9 重组质粒酶切鉴定

5.2.10 目的基因序列的测定与分析

5.3 结果与讨论

5.3.1 Bacillus sp.YX-1中温α-淀粉酶基因的扩增

5.3.2 PCR产物的克隆

5.3.3 Bacillus sp.YX-1中温α-淀粉酶基因的测序及序列分析

5.3.4 Bacillus sp.YX-1中温α-淀粉酶基因序列分析

5.4 小结

第六章 Bacillus sp.YX-1中温α-淀粉酶基因在大肠杆菌中的表达

6.1 前言

6.2 材料与方法

6.2.1 菌种与质粒

6.2.2 培养基与溶液

6.2.3 主要试剂

6.2.4 主要仪器

6.2.5 Bacillus sp.YX-1的培养及基因组DNA的提取

6.2.6 表达引物设计及目的基因的扩增

6.2.7 PCR扩增产物的回收纯化及浓缩

6.2.8 外源基因及质粒pET-28a的酶切

6.2.9 外源基因与质粒pET-28a的连接

6.2.10 表达重组质粒转化大肠杆菌

6.2.11 表达重组质粒的提取及鉴定

6.2.12 诱导表达培养

6.2.13 表达产物SDS-PAGE分析

6.2.14 酶活力及蛋白含量的测定

6.2.15 重组中温α-淀粉酶的纯化

6.3 结果与讨论

6.3.1 Bacillus sp.YX-1中温α-淀粉酶基因表达质粒的构建

6.3.2 表达产物的SDS-PAGE分析

6.3.3 酶活力的测定

6.3.4 Bacillus sp.YX-1中温α-淀粉酶基因表达效果的分析

6.3.5 重组α-淀粉酶的纯化

6.4 小结

主要结论

论文创新点

致谢

参考文献

附录：作者在攻读博士学位期间发表(含待发表)的论文

附图