FOXO1通过诱导心肌细胞自噬降低氧化自由基对其细胞损伤的分子生物学机制研究

摘要

本文通过研究FOXO1对于心肌细胞氧化应激损伤的作用，从而揭示FOXO1的功能是诱导氧化应激损伤还是保护损伤的心肌细胞，还是两个兼有。同时进一步研究心肌细胞特异性缺失FOXO1促进氧化应激导致的心肌细胞凋亡的机制和FOXO1过表达通过促进细胞自噬降低细胞凋亡的机制，本研究对于寻找抗心肌缺血再灌注损伤的药物治疗靶点，提高心肌梗死治疗疗效意义重大.
　　目的:
　　1.通过过氧化氢培养心肌细胞模拟过氧化自由基对心肌细胞损伤，检测过氧化氢对心肌细胞凋亡的影响，检测FOXO1在蛋白、mRNA以及磷酸化水平的变化。以探讨FOXO1对于心肌细胞氧化应激损伤的作用。
　　2.利用转染技术使FOXO1沉默，用不同浓度FOXO1-specific siRNA转染心肌细胞，检测FOXO1mRNA的含量、细胞凋亡比例。在200uM过氧化氢培养后，用不同浓度FOXO1-specific siRNA转染心肌细胞，检测caspase3含量、PARP含量、caspase3活性、自噬囊泡的形成以及及LC3Ⅱ与LC3Ⅰ的比值，以探讨FOXO1与过氧化氢培养下心肌细胞凋亡和自噬的相关机制。
　　方法:
　　1.细胞系处理方法:培养人类心肌细胞系H9c2，不同浓度过氧化氢培养细胞来模拟细胞受到氧化自由基损伤的模型，将培养好的H9c2细胞放置于0uM、50uM、100uM、200uM H2O2混合气体中培养24到48小时。
　　2.过氧化氢培养H9c2心肌细胞后检测细胞凋亡
　　H9c2心肌细胞用0uM和200uM过氧化氢分别培养24小时和48小时后，用AnnexinⅤ-FITC和碘化丙啶对H9c2心肌细胞进行染色，然后用流式细胞分析仪进行细胞凋亡检测，细胞凋亡的结果用凋亡细胞比全部细胞进行表示。
　　3.过氧化氢培养H9c2心肌细胞后检测caspase3和PARP蛋白以及caspase3活性表达。
　　0uM和200uM过氧化氢分别培养H9c2心肌细胞24小时和48小时，通过蛋白免疫印迹电泳法检测caspase3和PARP蛋白表达，通过荧光电泳法检测H9c2心肌细胞的caspase3活性的表达，
　　4.过氧化氢培养H9c2心肌细胞后检测FOXO1蛋白水平和FOXO1磷酸化表达
　　0uM、50uM、100uM、200uM过氧化氢培养H9c2心肌细胞后，用蛋白免疫印迹试验检测FOXOⅠ蛋白水平和FOXO1磷酸化表达。
　　5.过氧化氢培养H9c2心肌细胞后检测FOXO1mRNA水平表达
　　0uM、50uM、100uM、200uM过氧化氢培养H9c2心肌细胞后，用实时反转录PCR检测FOXO1 mRNA水平表达。
　　6.用FOXO1-specific siRNA转染H9c2心肌细胞，使FOXO1沉默
　　通过转染方法沉默FOXO1，用浓度为25nM、50nM的FOXO1-specific siRNA转染H9c2心肌细胞，未用FOXO1-specific siRNA只有脂质体处理的作为对照组。
　　7.FOXO1-specific siRNA转染H9c2心肌细胞后，检测FOXO1mRNA水平表达
　　用25nM、50nM FOXO1-specific siRNA转染H9c2心肌细胞后，用实时反转录PCR检测FOXO1-specific siRNA转染心肌细胞和空白对照组FOXO1 mRNA水平。
　　8.FOXO1-specific siRNA转染H9c2心肌细胞后，检测细胞凋亡
　　用25nM、50nMm FOXO1-specific siRNA转染H9c2心肌细胞后，用AnnexinⅤ-FITC和碘化丙啶对H9c2心肌细胞进行染色，然后用流式细胞分析仪检测FOXO1-specific siRNA转染心肌细胞组和空白对照组的细胞凋亡。
　　9.200uM过氧化氢培养FOXO1-specific siRNA转染心肌细胞和空白对照细胞后，检测caspase3活性以及caspase3和PARP蛋白表达。
　　200uM过氧化氢分别培养25nM、50nM FOXO1-specific siRNA心肌细胞和空白对照细胞后，通过荧光电泳法检测caspase3活性的表达，通过蛋白免疫印迹电泳法检测caspase3和PARP蛋白表达。
　　10.过氧化氢培养FOXO1-specific siRNA转染心肌细胞和空白对照细胞后，检测细胞自噬.
　　统计学处理:
　　全部数据采用SPSS13.0软件进行统计学分析，多组间不同组别间差异比较采用方差分析，有统计学意义后进行两两比较，采用LSD进行多重两两比较，两组间比较采用双尾t检验，显著性水平设定为0.05，当P值小于0.05，差异具有统计学意义。
　　结果:
　　1.过氧化氢培养H9c2心肌细胞后检测细胞凋亡:
　　随着过氧化氢培养浓度的增加、培养时间的延长，细胞凋亡增加。
　　2.3.过氧化氢培养H9c2心肌细胞后检测caspase3和PARP蛋白以及caspase3活性表达。
　　随着过氧化氢培养浓度的增加、培养时间的延长，caspase3和PARP蛋白以及caspase3活性表达增加。
　　3.过氧化氢培养H9c2心肌细胞后检测FOXO1蛋白水平、FOXO1mRNA水平和FOXO1磷酸化表达
　　用0uM、50uM、100uM、200 uM过氧化氢培养H9c2心肌细胞，FOXO1蛋白水平、FOXO1 mRNA水平组间差异无统计学意义。
　　与以上规律相反，H9c2心肌细胞在用0uM、50uM、100uM、200uM浓度的过氧化氢培养下，随着过氧化氢浓度的增高，FOXO1的磷酸化水平逐步升高，且差异均有统计学意义，磷酸化程度与过氧化氢浓度呈计量依赖性。
　　4.FOXO1-specific siRNA转染心肌细胞组和空白对照细胞组FOXO1mRNA的表达
　　FOXO1-specific siRNA转染细胞组FOXO1mRNA的表达低于空白对照细胞组，差异具有统计学意义(P＜0.01)，随着FOXO1-specific siRNA转染浓度的增大，FOXO1 mRNA的含量逐渐减小，组间差异有统计学意义(P＜0.01)。
　　5.FOXO1-specific siRNA转染心肌细胞和空白对照细胞凋亡检测
　　FOXO1-specific siRNA转染细胞组细胞凋亡高于空白对照组间，差异具有统计学意义(P＜0.05)，随着FOXO1-specific siRNA转染浓度的增大，细胞凋亡升高，组间差异有统计学意义(P＜0.05)。
　　6.200uM过氧化氢培养FOXO1-specific siRNA转染心肌细胞和空白对照细胞后，检测caspase3活性以及caspase3和PARP蛋白表达。
　　200uM的过氧化氢培养下的FOXO1-specific siRNA转染心肌细胞的caspase3活性以及caspase3和PARP蛋白表达均高于空白对照组(P＜0.05)。随着FOXO1-specific siRNA转染浓度增高而增高，caspase3活性以及caspase3和PARP蛋白表达增高，组间差异具有统计学意义(P＜0.05)。
　　7.过氧化氢培养FOXO1-specific siRNA转染心肌细胞和空白对照细胞后，检测细胞自噬
　　200 uM过氧化氢可以明显诱导对照组细胞自噬囊泡的形成（绿色荧光蛋白阴性点），200 uM过氧化氢培养下，50nM FOXO1-specific siRNA细胞组自噬囊泡低于对照组（绿色荧光蛋白阴性点），200 uM过氧化氢培养下，50nMFOXO1-specific siRNA细胞组的GFP-LC3、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ低于对照组(P＜0.05)。即FOXO1-specific siRNA转染H9c2心肌细胞组降低过氧化氢诱导自噬(p＜0.01).
　　结论：
　　1.过氧化氢损伤心肌细胞造模成功，并将心肌细胞FOXO1沉默（用FOXO1-specific siRNA转染H9c2细胞）。
　　2.随着过氧化氢浓度的升高和培养时间的延长，心肌细胞凋亡、caspase3、PARP蛋白水平及caspase3活性升高，呈剂量依赖性。提示过氧化氢诱导凋亡。
　　3.过氧化氢培养心肌细胞，FOXO1在蛋白和mRNA的水平未发生变化，随着过氧化氢的浓度增高，FOXO1磷酸化水平升高，提示过氧化氢诱导心肌细胞凋亡可能是通过促FOXO1磷酸化，进而抑制FOXO1对心肌细胞的修复作用。
　　4.在200uM过氧化氢培养后，随着FOXO1-specific siRNA转染浓度增高，细胞凋亡比例、caspase3含量、PARP含量以及caspase3活性增高。提示FOXO1沉默促进过氧化氢诱导的心肌细胞凋亡，进而说明FOXO1抑制过氧化氢诱导的心肌细胞凋亡。
　　5.200uM过氧化氢诱导对照组细胞自噬囊泡的形成，过氧化氢培养FOXO1-specific siRNAH9c2转染心肌细胞，自噬囊泡减少、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ降低。提示过氧化氢诱导心肌细胞自噬，FOXO1沉默降低过氧化氢诱导的心肌细胞自噬，进而说明FOXO1增强过氧化氢诱导的心肌细胞自噬。

目录

摘要

前言

第一部分 过氧化氢通过FOXO1磷酸化诱导心肌细胞凋亡机制的研究

1 材料与方法

2 结果

3 讨论

参考文献

第二部分 FOXO1基因沉默与过氧化氢诱导心肌细胞凋亡和自噬的关系相关机制的研究

1 材料与方法

2 结果

3 讨论

参考文献

全文小结

综述 心肌缺血／再灌注损伤保护作用机制的研究综述

缩写词简表

博士研究生期间发表论文情况

致谢

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