杜仲内生真菌分离鉴定及其次生代谢产物的初步研究

摘要

杜仲是我国特有的传统珍稀药材,列为国家二级保护植物,以补肝肾、强筋骨、降血压、抗衰老、抗肿瘤等良好的功效获得广泛应用。要对杜仲资源进行保护的同时满足人们的用药需求,就需要利用现代生物技术对其进行开发。利用微生物发酵生产植物活性物质就是开发途径之一。内生真菌普遍存在于各种植物组织当中,长期与宿主共存,可能具有重要的生防作用,有产生与宿主相同或相似的生物活性物质的潜力。本研究从这方面出发,对杜仲资源开发作了探索。主要研究内容及结果有： (1)从采自广东乐昌地区的杜仲的根、枝、叶、皮等组织分离内生真菌,各组织分离率依次为叶>根>枝>皮。研究了有效的表面消毒方法。根据分离得到的内生真菌形态及显微结构作了初步分类,再以ITS序列及18SrDNA序列测定结果比对分析,结合进化关系的研究,确定所分离的101株杜仲内生真菌中79株分属拟茎点霉、曲霉、刺盘孢霉、枝顶孢霉、镰孢霉、交链孢霉、瓶霉、壳针孢霉、内座壳菌9个属,以拟茎点霉、曲霉、刺盘孢霉最多。各组织中分布存在差异,根中主要为交链孢霉,叶、枝、皮中分别主要为拟茎点霉、曲霉、瓶霉。某些属仅存在于特定器官中,如交链孢霉、内座壳菌只分布于根中,瓶霉只存在于皮中。 (2)以杯碟法对部分杜仲内生真菌抑菌活性进行了研究,发现03(拟茎点霉)和05A(尖孢镰刀霉)对枯草芽孢杆菌有一定抑制作用,05A抑制力更强。通过对发酵产物进行HPLC测定,发现05A产绿原酸,发酵液中绿原酸含量1.04mg/L,05A、10(刺盘孢)、11B(镰孢菌)产桃叶珊瑚甙,发酵液中桃叶珊瑚甙浓度分别为17.2mg/L,32.3 mg/L,11.7mg/L。

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第一章绪 论

1.1植物内生真菌的研究概况

1.1.1内生菌的定义

1.1.2植物内生真菌的多样性

1.1.3内生真菌鉴定方法

1.1.4植物内生真菌活性研究概况

1.2杜仲资源利用的研究概况

1.2.1杜仲的药理学作用

1.2.2杜仲次生代谢产物的研究进展

1.3本课题研究的目的及意义

第二章材料与方法

2.1材料与仪器设备

2.1.1供试材料

2.1.2仪器

2.1.3主要试剂

2.2实验方法

2.2.1样品处理及消毒

2.2.2纯化

2.2.3形态特征鉴定

2.2.4分子生物学鉴定

2.2.5抑菌实验

2.2.6发酵产物中绿原酸的测定

2.2.7发酵产物中桃叶珊瑚甙的测定

第三章结果与讨论

3.1表面消毒效果

3.2各组织内生真菌分离情况

3.3形态观察

3.4分子生物学鉴定

3.4.1基因组提取及PCR

3.4.2测序比对结果

3.4.3进化关系分析

3.5类群分布研究

3.6抑菌实验

3.7杜仲内生真菌发酵产物中绿原酸测定

3.7.1绿原酸标准品测定

3.7.2发酵产物绿原酸测定

3.8杜仲内生真菌发酵产物中桃叶珊瑚甙测定

3.8.1桃叶珊瑚甙标准品测定

3.8.2发酵产物桃叶珊瑚甙测定

3.9本章小节

结论与展望

参考文献

攻读硕士学位期间取得的研究成果

致谢