乳糖诱导大肠杆菌表达重组高分子量蛛丝蛋白高密度发酵

摘要

天然蜘蛛丝由于良好力学性能和生物相容性，在生物医学领域有着广泛的应用前景。本实验室已经构建了高分子量重组蛛丝蛋白工程菌BL21(DE3)pLysS/pNSR32，表达重组蛛丝蛋白32聚体，分子量为102KD。但由于蜘蛛丝独特的编码序列，含有大量的丙氨酸和甘氨酸密码子，以及重组蛛丝蛋白32聚体分子量较高，其表达量比较低。 IPTG不仅价格昂贵，而且还会给人体带来潜在危害，本文从大规模发酵培养成本和产品安全角度考虑，改用乳糖为诱导剂，在了解摇瓶培养生长特性和表达条件后，于10L发酵罐中优化了高密度培养和高表达的发酵控制工艺，提高了重组蛛丝蛋白的发酵产量，并且初步摸索了重组蛛丝蛋白的纯化条件，为本室下游组织工程应用研究提供了重组蛛丝蛋白原材料。 本文首先研究了重组质粒pNSR32在宿主菌BL21(DE3)pLysS和BL21(DE3)中的表达情况，确定了合适的宿主菌BL21(DE3)。用乳糖替代IPTG作为诱导剂，发现乳糖对促进BL21(DE3)/pNSR32生长和提高重组蛛丝蛋白表达表达量的效果均优于IPTG。通过摇瓶实验还考察了BL21(DE3)/pNSR32发酵培养基，诱导强度，诱导时机，诱导时间，装液量，诱导后培养温度，诱导后培养pH值，乙酸钠对工程菌生长和重组蛛丝蛋白表达的影响，诱导对宿主蛋白表达的影响，重组质粒稳定性等条件。 在10L发酵罐分批发酵中初步验证了摇瓶培养条件，并且在不同的溶氧水平下培养观察到大于30％的溶氧就能较好的促进菌体生长。高密度发酵采用pH-stat结合溶氧反馈及梯度增加的补料方法，优化了高密度发酵诱导时机，诱导前后的碳源及乳糖诱导方式，发酵最高密度OD600 nm最高达到130，干重达到55.83g/L(DCM)，重组蛛丝蛋白表达量达到26％。 在重组蛛丝蛋白初步纯化实验中，通过加热出去大部分杂蛋白后，用硫酸铵沉淀，能够得到电泳纯的重组蛛丝蛋白。此方法工艺简单，适合大规模纯化，但得率有待进一步提高。

目录

文摘

英文文摘

声明

绪论

一.蛛丝蛋白

1.蜘蛛丝

2.蜘蛛丝的力学性能

3.蛛丝的生物相容性

4.蛛丝蛋白的基因工程研究

5.蛛丝蛋白的应用

二.外源基因在大肠杆菌中的表达

1.表达载体的影响

2.目的基因序列对表达的影响

3.质粒的拷贝数及稳定性

4.表达策略

5.宿主菌对表达效率的影响

6.培养条件的影响

三.重组大肠杆菌高密度发酵

1.培养方式

2.补料策略

3.比生长速率的控制

4.代谢副产物

四.本研究的背景、内容及意义

1.本研究的背景

2.本研究的主要内容

3.本研究的意义

第一章BL21(DE3)/pNSR32摇瓶培养生长特性及表达条件优化

第一节材料与方法

一.材料

二.方法

第二节结果及讨论

一.不同宿主菌表达的比较

二.BL21(DE3)/pNSR32乳糖和IPTG诱导比较及诱导强度

三.发酵培养基优化

四.摇瓶培养特性

五.工程菌质粒稳定性

第三节小结

第二章BL21(DE3)/pNSR32的分批发酵培养

第一节材料与方法

一.材料

二.方法

第二节结果及讨论

一.菌体OD600值与干重的关系

二.溶氧对BL21(DE3)/pNSR32生长和重组蛛丝蛋白表达的影响

三.BL21(DE3)/pNSR32的自动诱导表达

第三节小结

第三章BL21(DE3)/pNSR32分批补料高密度发酵

第一节材料与方法

一.材料

二.方法

第二节结果及讨论

一.不同碳源对BL21(DE3)/pNSR32生长和重组蛛丝蛋白表达的影响

二.诱导时机对BL21(DE3)/pNSR32生长和重组蛛丝蛋白表达的影响

三.诱导后补糖速度对BL21(DE3)/pNSR32生长和表达的影响

四.诱导后碳源对BL21(DE3)/pNSR32生长和重组蛛丝蛋白表达的影响

五.乳糖诱导方式对BL21(DE3)/pNSR32生长和重组蛛丝蛋白表达的影响

第三节小结

第四章 重组蛛丝蛋白的初步纯化

第一节材料与方法

一.材料

二.方法

第二节结果及讨论

一.加热变性杂蛋白

二.调pH值除杂蛋白

三.硫酸铵沉淀收集重组蛛丝蛋白

第三节小结

第五章结论

参考文献

攻读学位期间承担的科研任务与主要成果

致谢

个人简历