高分子量RGD-蛛丝蛋白重组体构建、高密度发酵及纯化

摘要

蜘蛛丝既轻又坚韧，是自然界综合性能优良的天然蛋白质纤维之一，因其具有良好的生物相容性和可降解性在生物医学领域具有潜在的应用前景。精氨酸．甘氨酸．天门冬氨酸(RGD)是许多粘附蛋白的高度保守氨基酸序列，生物材料表面结合RGD肽有助于细胞在材料上的粘附、迁移和增殖。本室先前运用基因工程的方法，将具有特定信号识别功能的RGD三肽模体与蛛丝蛋白基因重组，构建了具有RGD三肽编码子和蛛丝蛋白基因16多聚体的克隆重组子pDSR16，首次生物合成RGD三肽和蛛丝蛋白16多聚体(pNSR16)。但在利用16多聚体重组蛛丝蛋白作原料制备生物材料的研究中，观察到因其与天然蛛丝蛋白在分子量上的差距较大，影响了材料性能的表征。 因此，在本室已经构建的RGD-蜘蛛拖丝蛋白基因16多聚体基础上，通过首尾相连、倍加等方法进一步多聚化，得到RGD-蜘蛛拖丝蛋白基因32和64多聚体，分别将这两种多聚体与原核高效表达载体pET-30a(+)连接，转化大肠杆菌BL21(DE3)pLysS，得到的32多聚体表达重组子命名为pNSR32，64多聚体表达重组子命名为pNSR64。通过酶切、琼脂糖电泳鉴定及对目的片断的测序均与理论值相符。将32和64多聚体基因序列登陆GenBank，序列号分别为DQ469929和DQ837297。重组体pNSR32和pNSR64经IPTG诱导表达，SDS-PAGE图谱显示表达产物分子量分别为102KD和196.6KD，与天然蛛丝蛋白分子量接近并与理论值相吻合。高分子量的蛛丝蛋白在原核生物成功实现高效表达，在国内外尚未见报道。在此基础上，对pNSR32工程菌进行高密度发酵条件摸索并建立了简单高效的目的蛋白纯化工艺。

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摘要

中文文摘

第1章绪论

1.1蜘蛛丝的研究进展

1.1.1蜘蛛丝纤维的来源及组成

1.1.2蜘蛛丝的性能

1.1.3蜘蛛丝基因工程研究进展

1.1.4蜘蛛丝的应用

1.2基因工程菌高密度发酵研究进展

1.2.1原核表达系统的研究进展

1.2.2高密度发酵研究进展

1.2.3大肠杆菌外源基因的表达

1.2.4宿主和载体

1.2.5目的基因的表达及调控

1.3研究的目的、内容与意义

1.3.1研究目的

1.3.2研究的内容

1.3.3研究的意义

第2章材料与方法

2.1材料

2.1.1主要仪器

2.1.2主要药品

2.1.3菌株和载体

2.1.4软件

2.1.5常用培养基和缓冲液

2.2方法

2.2.1 pSDR32和pSDR64重组子的构建

2.2.2 pNSR32及pNSR64重组表达工程菌的构建

2.2.3 pNSR32和pNSR64基因工程菌的摇瓶表达

2.2.4 pNSR32基因工程菌的高密度发酵

2.2.5 RGD-蛛丝蛋白32聚体的纯化方法

第3章结果与分析

3.1 pSDR32和pSDR64重组子的构建及鉴定

3.2 pNSR32和pNSR64基因工程菌的构建及鉴定

3.3 pNSR32和pNSR64重组蛋白在大肠杆菌中的表达及鉴定

3.4 pNSR32基因工程菌分批补料高密度发酵

3.5 pNSR32重组蛋白的分离与纯化条件摸索

第4章讨论

4.1高分子量RGD-蛛丝蛋白重组体构建

4.2高密度发酵条件的摸索

4.3对重组蛋白的纯化工艺进行摸索

结论

参考文献

附录

攻读硕士学位期间承担的科研任务与主要成果

致谢

个人简历